TaKaRa RNA LA PCR™ Kit (AMV) Ver.1.1

サンプルRNA：ヒト培養細胞HL60由来 total RNA
ターゲット：トランスフェリンレセプター（TFR）
増幅サイズ：1,105 kb

図 3'-RACE法の原理図

1. 下記に示す反応液を調製する。

   試薬	使用量	最終濃度
   MgCl2	2 μl	5 mM
   10 × RNA PCR Buffer	1 μl	1 ×
   RNase Free dH2O	4.25 μl
   dNTP Mixture（各10 mM）	1 μl	1 mM
   RNase Inhibitor	0.25 μl	1 U/μl
   AMV Reverse Transcriptase XL	0.5 μl	0.25 U/μl
   Oligo dT-Adaptor Prime	0.5 μl	0.125 μM
   HL 60由来 total RNA（1 μg/μl）	0.5 μl	0.5 μg
   Total	10 μl/sample

2. 調製済のチューブをサーマルサイクラーにセットし、右のプログラムで反応を行う。

   30℃、10 min	1 cycle
   50℃、30 min
   95℃、2 min
   5℃、5 min

1. 下記に示す反応液を調製する。

   試薬	使用量	最終濃度（反応液100 μl）
   MgCl2	3 μl	2.5 mM
   10×LA PCR Buffer II（Mg2＋ Free）	4 μl	1×
   滅菌精製水	31.75 μl
   TaKaRa LA Taq	0.25 μl	1.25 U/50 μl
   M13 Primer M4	0.5 μl	0.2 μM
   TFR-1 Primer	0.5 μl	0.2 μM
   Total	40 μl/sample

2. 1. の反応液40 μlをA. -2. で逆転写反応を終了したチューブに添加する。
3. 調製したチューブをサーマルサイクラーにセットし、右のプログラムで反応を行う。

   94℃、30 sec	30 cycle
   55℃、30 sec
   72℃、5 min

4. 反応終了後、反応液の一部（5 μl）をアガロース電気泳動で確認する。目的の増幅フラグメント（1,105 bp）が確認できる。