長鎖mRNA（約12 kb）の増幅
サンプルRNA：ヒト心臓由来mRNA
ターゲット：ジストロフィン
増幅サイズ：12 kb
ターゲット：ジストロフィン
増幅サイズ：12 kb
A．逆転写反応
- 下記に示す反応液を調製する。
試薬 使用量 最終濃度 MgCl2 2 μl 5 mM 10 × RNA PCR Buffer 1 μl 1 × RNase Free dH2O 4.5 μl dNTP Mixture（各 10 mM） 1 μl 1 mM RNase Inhibitor 0.25 μl 1 U/μl AMV Reverse Transcriptase XL 0.5 μl 0.25 U/μl Random 9 mers 0.5 μl 2.5 μM ヒト心臓由来mRNA 0.25 μl 0.25 μg Total 10 μl/sample - 調製済のチューブをサーマルサイクラーにセットし、次のプログラムで反応を行う。
30℃、10 min 1 cycle 42℃、50 min 70℃、15 min
B．PCR
- 下記に示す反応液を調製する。
試薬 使用量 最終濃度 MgCl2 3 μl 2.5 mM 10 × LA PCR Buffer II（Mg2＋ Free） 4 μl 1 × 滅菌精製水 31.75 μl TaKaRa LA Taq 0.25 μl 1.25 U/50 μl sense primerとantisense primer 各0.5 μl 各0.2 μM Total 40 μl/sample - 1. の反応液40 μlをA. -2. で逆転写反応を終了したチューブに添加する。
- 調製したチューブをサーマルサイクラーにセットし、次のプログラムで反応を行う。
94℃、30 sec 30 cycle 65℃、15 min - 反応終了後、反応液の一部（5 μl）をアガロースゲル電気泳動で確認する。目的の増幅フラグメント（12 kb）が確認できる。
Lane 1： 6 kb 2： 8 kb 3： 12.2 kb M： λ-Hind III digest
