pPTR II DNA

pPTR I（製品コード 3621）およびpPTR II（製品コード 3622）は、A. oryzae由来pyrithiamine（PT）耐性遺伝子ptrA^1）を選択マーカーとしてもつ、麹菌A. oryzaeを始めとするAspergillus属真菌形質転換用のベクターである。チアミン不含PT含有培地で形質転換体を選択することができる。PT感受性（表1）でプロトプラスト調製が比較的容易な糸状菌A. kawachii、A. terreus、A. fumigatus、Trichoderma reeseiにおいても、本システムで形質転換体が取得できることが確認できたので^2）、以下に示す。

実験1：pPTR IおよびIIによる形質転換効率

【方法】
pPTR I（染色体組込み型）およびII（自律複製型）をプロトプラスト-PEG法^3）によりA. kawachii、A. terreus、A. fumigatus、Trichoderma reeseiに導入した。
選択培地として、0.1 μg/ml PTを含むCzapeck-Dox（CD）最少培地を用いた（T. reeseiのみtop agarに0.02％ Casamino acidを添加）。
30℃で7～10日間培養した後、選択培地上に出現したコロニー数を計数した。 【結果】
各菌株における形質転換効率を表2に示す。

表2 各菌株の形質転換効率（コロニー数／μgプラスミドDNA）

菌株	プラスミド
	pPTR I	pPTR II
A. nidulans A89	76	1878
A. oryzae RIB128	6.6	344
A. kawachii IFO4308	0.8	65
A. terreus IFO30537	0.8	100
A. fumigatus TIMM2726	0.6	42
Trichoderma reesei IFO31326	8	490

【方法】
A. oryzae glaA promoter-E. coli uidA（GUS遺伝子をコードする）-A. oryzae amyB terminatorからなるキメラ遺伝子^4）をpPTR IIに挿入してpPTR II-GUSを作製し、これを用いて（A）A. kawachii、（B）A. fumigatusを形質転換した。
選択培地として、0.1 μg/ml PT、0.8 M NaClを含むCD最少培地を用いた。
生成した形質転換体を採取し、0.1 μg/ml PT、1%デキストリン、50 μg/ml X-gluc、0.3％ Triton Xを含むCD最少培地（発現培地）に移し、5～15日間培養後、GUSタンパク発現による青色呈色の有無を観察した。 【結果】
A. kawachii、A. fumigatusの両方で形質転換体が得られ、発現培地上でGUS発現由来の青色呈色が確認された（図1）。

	プラスミド（－）	選択培地	発現培地
（A）
（B）

図1　形質転換体の選択とGUSタンパク発現
（A）A. kawachii；（B）A. fumigatus

【参考文献】
　1）Kubodera, T.et al.（2000）Biosci. Biotechnol. Biochem.,64（7）, 1416-1421.
　2）Kubodera, T.et al.Biosci. Biotechnol. Biochem.（submitted）
　3）BIO VIEW（2000）33, p22-23.
　4）Hata, Y.et al.（1992）Curr. Genet.,22（2）, 85-91.