in vitro Transcription T7 Kit (for siRNA Synthesis)

本キットでin vitro transcription可能な鎖長の検討を行った。
T7プロモーター配列を5' 部分に付加したλDNA増幅用プライマー (T7 lambda 1)と、アンチセンスプライマーを用いてPCRを行い、2 kb、4 kb、6 kb、8 kb、10 kb、12 kb、15 kbの増幅フラグメントを作製して精製し、OD₂₆₀測定後、これらを鋳型としてin vitro transcription反応を行った。

鋳型DNAの確認 1. 2 kbp 2. 4 kbp 3. 6 kbp 4. 8 kbp 5. 10 kbp 6. 12 kbp 7. 15 kbp M λ-Hind III digest

【方法】

Template使用量は、50 ng (2 kbp)、100 ng (4、6、8 kbp)、200 ng (10、12 kbp) および380 ng (15 kbp) とした。　反応系は20 μlとし、 42℃で2 時間反応を行った。 反応終了後、反応液1 μlとRNAサンプルバッファー^*19 μlを混合し、65℃、15分間の熱処理を行ったもの、および行わなかったもの、それぞれ2 μlを電気泳動で確認した。
　 (* RNAサンプルバッファー: 64%ホルムアミド、26 mM MOPS pH7.2、6.45 mM酢酸ナトリウム、0.6 mM EDTA)

【結果】

熱処理なし

65℃、15分熱処理後泳動

使用した鋳型DNA 1. 2 kbp 2. 4 kbp 3. 6 kbp 4. 8 kbp 5. 10 kbp 6. 12 kbp 7. 15 kbp M λ-Hind III digest 1%アガロースゲル電気泳動

鋳型として2～15 kbpのDNAを使用した場合、それぞれ対応するtranscrip RNAが得られることが確認された。