Adenovirus Dual Expression Kit (CAG/EF1α)

以下は、最適な条件で、効率よく組換えウイルスを拡大調製するための方法です。
さらに組換えウイルスを増やしたいという場合は、このプロトコールに従って拡大調製を行って下さい。
効率よく組換えウイルスを増やすためには、そのウイルスの力価が必要です。ウイルスの力価がわからない場合には、まず「プロトコール D. 力価測定」に従い、種ウイルスの力価を測定する必要があります。

1. コラーゲンコート75 cm²フラスコに70～100％ コンルフエントまで培養した293細胞を用意する。
   ＊ ここでは、75 cm²フラスコスケールでの調製を示します。さらに量が必要な場合には、スケールアップして下さい。
2. 5%FCS-DMEMで、組換えウイルス液を希釈し0.5～1.0×10⁸ PFU/mlのウイルス液を調製する。
3. フラスコから培地を除いた後、2.のウイルス液 2 mlを静かに加える。
   ＊ アデノウイルスを293細胞に感染、増殖させるとき、MOI(重複感染度; Multiplicity of infection)=10～20（PFU/cell）で感染を行うと効率よくウイルスを増殖させることができます。高い力価のウイルス液を得ようとして、293細胞に濃いウイルス液を感染させると、細胞が死滅してしまい、かえって力価が低下してしまうことがあります。
4. フラスコをシーソーのように数回、ゆっくりと振とうさせ、ウイルス液をすべての細胞にいきわたらせ感染を行う。この操作を15～20分ごとに3～4回行う。この間、細胞はCO₂インキュベーター（37℃、5% CO₂）においておく。
5. 1時間の感染後、5% FCS-DMEM 13 mlを加える。
6. 3～4日後、完全に細胞が変性したら、培地ごと細胞を無菌的に滅菌チューブに移し、凍結融解または密閉型ソニケーターで破砕して、ウイルスを遊離させる。
7. 3000 rpm、10分、4℃で遠心し上清を回収する。
8. シーリングキャップ付マイクロチューブに、使用目的にあわせて必要量ずつ分注し、ドライアイスで急凍して‐80℃で保存する。
9. 分注したチューブの1本を融解し、力価を測定「プロトコールD.」したのち実験に用いる。
   ＊ 「プロトコールC.」と同様、「同、B-2.」の方法で構造確認、および RCAチェックを行った後に実験に用いることをお勧めします。