ApopLadder Ex™
（Apoptotic DNA Fragments Extraction Kit）

１．本製品以外に必要な器具および試薬

・マイクロピペット	・1.5 mlエッペンチューブ
・37℃インキュベーター	・TE バッファー
・56℃インキュベーター	・PBS（－）バッファー
・ボルテックスミキサー	・エタノール
・高速遠心機	・80％エタノール
・低速遠心機

（断片化DNAを検出するためには、その他に、電気泳動装置、蛍光イメージアナライザーFMBIO II Multi-View、蛍光色素SYBR Green I等の、目的に合った装置および試薬が必要となります。 電気泳動用ゲルローディングバッファーについては、６×Loading buffer をキットの中に準備いたしておりますので、ご利用下さい。）

2．操作手順

1. 10⁵～10⁶の細胞を、PBS（－）バッファーで一回洗浄、少量のPBS（－）バッファーに浮遊させ、1.5 mlエッペンチューブに移し遠心機で1,600×g、5分間遠心する。

2. 上清を除去、細胞ペレットを1.5 mlエッペンチューブの底をかるく叩いて浮遊させてから、Lysis buffer 100 μlを加え、ボルテックスミキサーで10秒間撹拌する。

3. 1,100×gで5分間遠心分離し、上清を別の1.5 mlエッペンチューブに移す。

4. 3. で残ったペレットを2. と同様に1.5 mlエッペンチューブの底をかるく叩いて浮遊させてから、Lysis buffer 100 μlを加え、ボルテックスミキサーで10秒間撹拌する。

5. 1,100×gで5分間遠心分離し、上清を3. の1.5 mlエッペンチューブに合わせて、粗抽出液を得る。

6. 5. の粗抽出液に10％ SDS solutionを20 μl添加した後、Enzyme Aを20 μl 加え、56℃、1時間、反応させる。

7. 6. にEnzyme Bを20 μl 加え、37℃、1時間、反応させる。

8. Precipitant 130 μlを加えた後、0.95 mlのエタノールを加え－20℃に放置し、断片化DNAを十分沈殿させる。

9. 12,000×gで、約15分遠心し、上清を捨て、80％エタノールで洗浄する。

10. 再度、同様に遠心分離した後、エタノールを除き乾燥させる。

11. 10. に適当量のTEバッファー（10～50μl程度）を加え良く撹拌し完全に融解したものを、DNA電気泳動や96穴マイクロタイタープレートを用いた各種分析の試料とする。