Aureobasidin A

キット以外に必要な試薬

YPD 培地	：	1％Yeast extract、2％ Polypeptone、2％ D-glucose
YPD 寒天培地	：	YPD培地に2％の寒天を加える。
選択培地	：	≧ 0.5 μg/ml Aureobasidin Aを含むYPD寒天培地。

　　※使用する宿主株によってAureobasidin Aに対する感受性が若干異なる。

Aureobasidin A ストック溶液	：	500 μg/mlとなるようにエタノールまたはメタノールに溶解。 4℃保存（長期保存可）。
Carrier DNA	：	サケ精子DNA（10 mg/ml）を超音波処理で切断（3 kbp～15 kbp）後、10分間、100℃処理し急冷後、使用する。
Solution A	：	0.1M Lithium acetate、10 mM Tris-HCl（pH 7.5）、1mM EDTA ＊1
Solution B	：	40 g Polyethylene Glycol 4000を100 ml Solution Aに溶解する＊1。（要時調製＊2）

*1 Solution A、 Bはフィルター滅菌する。
*2 Solution Bは形質転換効率を高めるために要時調製すること。

操作手順

1．一晩30℃で培養した酵母の培養液0.5 mlを50 mlのYPD培地に加える。
2．30℃でOD₆₆₀＝1～2（二倍体では2～4）となるまで培養する（約6時間）。
3．1,000×g、 5分間の遠心により集菌する。
4．菌体を10 mlのSolution Aに懸濁し、再度1,000×g、5分間の遠心により集菌する。
5．菌体を最終濃度がOD₆₆₀＝150となるようにSolution Aに懸濁する。
6．マイクロ遠心チューブに細胞懸濁液100 μlを分注し、30℃1時間インキュベートする。
7．5 μgのDNA（プラスミド状態もしくは直鎖状DNA）と150 μg Carrier DNA（Total 20 μl）を加える。
　　※pAUR101の場合、プラスミドをBstP I 、EcoO65 I 、BsiW I またはStu Iで切断し、直鎖状にした後、形質転換に用いる。
8．850 μlのSolution Bを加え、静かに混合する。
9．30℃で30分間インキュベートした後、42℃で15分間熱処理する。
10．10分間室温で静置する。
11．5,000 rpm、1分間の遠心により集菌し、YPD培地 5 mlに再懸濁する。
12．30℃で6時間から一晩培養する。
13．遠心により集菌した菌体を1 ml～数 mlの0.9％ NaClに懸濁し、100 μlずつをYPD選択培地にまく。30℃で培養した場合、2～4日で形質転換体が現れる。

Aureobasidin Aを用いた酵母Saccharomyces cerevisiaeの形質転換法（酢酸リチウム法）
宿主株をYPD培地（5 ml）で一晩培養
　　↓
YPD培地（50 ml/500 ml三角フラスコ）に1～1.5％植菌
　　↓
30℃でOD₆₆₀＝1～2（二倍体は2～4）まで振とう培養（約6時間）
　　↓
集菌後、Solution A 10 mlで洗浄し、再び集菌
　　↓
菌体をOD₆₆₀＝150となるように、Solution Aに懸濁
　　↓
1.5 mlマイクロチューブに100 μlずつ分注し、30℃で1時間インキュベート
　　↓
5 μg DNA（plasmid or linear）と150 μg Carrier DNA（Total 20 μl）を添加
　　↓
850 μl Solution Bを添加し、緩やかに混合
　　↓
30℃で30分間インキュベート
　　↓
42℃で15分間、熱処理
　　↓
室温で10分間静置後、5,000 rpm ×1分間で集菌
　　↓
YPD培地5～10 mlに懸濁し、30℃で6時間～overnight（O/N）培養
　　↓
集菌し洗浄後、生理食塩水（1～5 ml）に懸濁
　　↓
Aureobasidin Aを含むYPD選択プレートに100 μlずつ塗布
　　↓
30℃で培養、2～4日でAureobasidin A耐性クローンが生育