5'-Full RACE Core Set

■ 反応液組成

polyA＋ RNA or Total RNA	0.5～5 μg
10×RT Buffer	1.5 μl
RNase Inhibitor （40 U/μl）	0.5 μl
AMV Reverse Transcriptase XL （5 U/μl）	1 μl
5'末端リン酸化 RT-プライマー* （200 pmol/μl）	1 μl
RNase free dH2O	up to 15 μl

*　RT-プライマーは、ライゲーションの際に必要であるため5'リン酸化したものを用いる。合成時にリン酸化しておくとよい。また、12～15 merの長さのものが適している。
■ 操作手順

1. 上記反応液を調製する。
2. TaKaRa PCR Thermal Cycler Diceにセットし、以下の条件で反応を行う。
   30℃、10 min
   ↓
   50℃、30～60 min
   ↓
   80℃、2 min
   ↓
   4℃

■ 反応液組成

1st strand cDNA溶液	15 μl
5×Hybrid RNA Degradation Buffer	15 μl
滅菌精製水	45 μl
Total	75 μl

■ 操作手順

1. 上記反応液を調製する。
2. RNase Hを1 μl加え、30℃で1時間反応を行う。
3. 反応終了後、エタノール沈殿を行う。

■ 反応液組成

5×RNA （ssDNA） Ligation Buffer	8 μl
滅菌精製水	12 μl
Total	20 μl

■操作手順

1. 上記反応液を調製する。
2. エタノール沈殿により回収した一本鎖cDNAの沈殿に上記反応液を加えてよく混和する。
3. 40％ PEG #6000 20 μlを加える。
4. T4 RNA Ligaseを1 μl加えて16℃で一晩（15～18時間）反応を行う。
5. 反応を開始するまで－20℃で保存。

PCR反応は、TaKaRa Taq（製品コード R001）、TaKaRa EX Taq（製品コード RR001）、TaKaRa PCR Amplification Kit（製品コード R011）、TaKaRa LA PCR Kit Ver. 2.1（製品コード RR013）、Premix Taq（TaKaRa Taq Version 2.0）（製品コード R004A）、Premix Taq（EX Taq　Version 2.0）（製品コード RR003）、One Shot LA PCR Mix（製品コード RR004）のいずれを用いても行うことが可能である。通常、TaKaRa Taqを用いた反応で大丈夫だが、目的とするターゲットの鎖長が長い場合や、高い増幅効率を望まれる場合は、TaKaRa EX Taq あるいはTaKaRa LA PCR Kit Ver. 2.1を使用した場合の方が良好な結果が得られると思われる。

＜TaKaRa LA PCR Kit Ver. 2.1を用いた反応例＞

ライゲーション反応の終わったサンプルをTE bufferにて10倍希釈したものをtemplateとして使用し、反応を行う。

（1）1st PCR反応
■ 反応液組成

template	1 μl
10×LA PCR Buffer II（Mg2＋plus）	5 μl
dNTP Mixture（各2.5 mM）	8 μl
1st PCR用primer S1（20 pmol/μl）	0.5 μl
1st PCR用primer A1（20 pmol/μl）	0.5 μl
TaKaRa LA Taq（5 U/μl）	0.5 μl
滅菌精製水	up to 50 μl

■ 操作手順

1. 上記反応液を調製する。
2. TaKaRa PCR Thermal Cycler Diceにセットし、以下の条件で反応を行う。
   

   94℃、3 min
   ↓
   94℃、30 sec	25 cycles
   50～65℃、30 sec
   68～72℃、0.5～5 min

（2）2nd PCR反応
■ 反応液組成

1st PCR solution*1	1 μl
10×LA PCR Buffer II（Mg2＋plus）	5 μl
dNTP Mixture（各2.5 mM）	8 μl
2nd PCR用primer S2（20 pmol/μl）	0.5 μl
2nd PCR用primer A2（20 pmol/μl）	0.5 μl
TaKaRa LA Taq（5 U/μl）	0.5 μl
滅菌精製水	up to 50 μl

*1 鮮明なPCR増幅産物を得るためには、1st PCR反応液の原液、10倍希釈液、100倍希釈液の、それぞれ1 μlを2nd PCR溶液に加え、3通りのPCRを行うことを推奨する。

■ 操作手順

1. 上記反応液を調製する。
2. TaKaRa PCR Thermal Cycler Diceにセットし、以下の条件で反応を行う。
   

   94℃、30 sec	25～30 cycles
   50～65℃、30 sec
   68～72℃、0.5～5 min

3. 反応終了後、反応液の一部を電気泳動し解析を行う。