T4 DNA Polymerase

1．マイクロ遠心チューブ内で以下の反応液を調製し、全量を9 μlにする。

突出末端インサートDNA	0.1 pmol以上
10×T4 DNA Polymerase Buffer	1 μl
0.1% BSA	1 μl
1.7 mM dNTP Mixture	1 μl
dH2O	up to 9 μl

2．DNAの末端のアニーリングを防ぐため、70℃で5分間保温した後、37℃の恒温槽に移す。
3. T4 DNA Polymerase（1 U/μl）1 μlを加え、ピペッティングにより穏やかに混和する（この時、ボルテックス等による激しい攪拌は避ける）。
4. 37℃で5分間保温する。
5. ボルテックス等で激しく攪拌して酵素を失活させる(ボルテックスによる攪拌で酵素はほとんど失活するが、過剰の反応を避けるために氷水下に置き、すぐに次のライゲーション反応を行うこと。すぐに次の操作に移らない場合は、フェノール/クロロホルム処理、エタノール沈殿してから－20℃で保存すること）。