Reverse Transcriptase XL (AMV)を用いたcDNA合成反応例
操作手順
1．以下の反応液を調製する。
2．42℃*3で30～60分間反応する。
3． 氷中に移し、冷却する。
*1：二次構造が強い鋳型RNAを用いる場合は、反応の前にRNA溶液を65℃で5分加熱後、氷中で急冷する操作を加えることにより、二次構造の影響を緩和することができる。
*2：Reverse Transcriptase XL（AMV)（製品コード 2620A/B）に添付
( 250 mM Tris-HCl(pH8.3)，50 mM MgCl2，20 mM DTT, 500 mM KCl)
*3：Reverse Transcriptase XL（AMV)は60℃でも逆転写酵素反応を行うことが可能である。ただし、高温で反応性が悪い場合は、42℃付近で反応する。
プライマーにRandom Primerを用いる場合は、Random PrimerとサンプルRNAが42℃で十分アニーリングできるような長さになるまで伸長するように、あらかじめ30℃で10分間逆転写反応を行う。
| Total RNA*1 （またはpolyA RNA) | 5～10 μg (1～2μg） |
| Oligo dT Primer またはRamdom Primer | 0.5～1 μg 0.5 μg |
| Reverse Transcriptase XL (AMV) Buffer*2 | 2.5 μl |
| 2.5mM dNTP Mixture | 2 μl （final 0.2mM） |
| RNase Inhibitor | 25 U |
| Reverse Transcriptase XL (AMV) | 25 U |
| 滅菌精製水 | 25 μlにfill up |
*2：Reverse Transcriptase XL（AMV)（製品コード 2620A/B）に添付
( 250 mM Tris-HCl(pH8.3)，50 mM MgCl2，20 mM DTT, 500 mM KCl)
*3：Reverse Transcriptase XL（AMV)は60℃でも逆転写酵素反応を行うことが可能である。ただし、高温で反応性が悪い場合は、42℃付近で反応する。
プライマーにRandom Primerを用いる場合は、Random PrimerとサンプルRNAが42℃で十分アニーリングできるような長さになるまで伸長するように、あらかじめ30℃で10分間逆転写反応を行う。
