PrimeScript™ RT-PCR Kitの操作方法（製品コード RR014A）
- 鋳型RNAの変性および逆転写反応
A-1. 下記に示す反応液を調製する。試薬 使用量 dNTP Mixture（10 mM each） 1 μl Oligo dT Primer （2.5 μM）
or Random 6 mers（20 μM）
or Specific Primer（2 μM）*11 μl Template RNA*2
or Positive Control RNA
4×105 copiesRNase Free dH2O up to 10 μl
*1 反応に用いるプライマーはOligo dT Primer、Random 6 mers、特異的下流プライマー（Control RNA の場合はR-1 Primer）のいずれかを選択。 *2 Template RNAは、8 μlまで持ち込むことができる。total RNAの場合、5 μgまで使用できる（推奨使用量：100 pg～1 μg）。
A-2. 調製済みのチューブをサーマルサイクラーにセットし、次のプログラムで変性・アニーリングを行う。
65℃、5 min.
4℃
＜重要＞この変性・アニーリング操作により、鋳型RNAの変性と、逆転写プライマーの鋳型RNAへの特異的なアニ－リングが効率的に行われ、逆転写効率が向上する。
A-3. 変性・アニーリング済み反応液に以下のように試薬を添加する。試薬 使用量 A-2 の変性・アニーリング済み反応液 10 μl 5 × PrimeScript Buffer 4 μl RNase Inhibitor 0.5 μl PrimeScript RTase 0.5 μl RNase Free dH2O 5 μl Total volume 20 μl
A-4. チューブをサーマルサイクラーにセットし、次のプログラムで逆転写反応を行う。（30℃
10 min. ）*3 42℃（～ 50℃） 15～30 min. 95℃ 5 min.*4 4℃
*3 逆転写反応にRandom 6 mersを用いる場合、42℃（～50℃）での反応の前に追加で行う。この操作によりRandom 6 mersが42℃（～50℃）で鋳型RNAと充分アニーリングできる長さになるまで伸長し、逆転写効率が向上する。 *4 長鎖を増幅する場合は、1stストランドcDNAにニックなどのダメージを与えないように、70℃、15 minの失活操作を行うこと。
＜重要＞ PrimeScript RTaseは、高次構造にも強い伸長性を示すので、通常の反応は42℃で行う。特異的下流プライマーを逆転写プライマーとして使用した場合、ミスプライミングによる非特異的な増幅産物が生じることがある。そのような場合は、反応温度を50℃にすることで改善が見られる。 - PCR反応
B-1. 下記に示す反応液を調製する。試薬 使用量 最終濃度
［または反応系に加える量］10×PCR Buffer II 5 μl 1× dNTP Mixture（10 mM each） 2 μl 400 μM 上流Primer（20 μM）*5（センス） 0.5 μl 0.2 μM 下流Primer（20 μM）*6（アンチセンス） 0.5 μl 0.2 μM TaKaRa Ex Taq HS 0.5 μl 2.5 U A-4 の逆転写反応液 ≦ 5 μl 滅菌水 up to 50 μl
*5 Positive Control RNAの場合、F-1 Primer
*6 Positive Control RNAの場合、R-1 Primer
B-2. 調製したチューブをサーマルサイクラーにセットし、至適プログラムでPCRを行う。
一般的な反応条件
（A） 3 step PCRの場合 （B） 2 step PCRの場合 94℃
55～65℃
72℃30 sec.
30 sec.
1 min./kb30 cycles 98℃
68℃10 sec.
1 min./kb30 cycles
Positive Control RNAの場合*7
94℃
60℃
72℃30 sec.
30 sec.
1 min30 cycles
*7 逆転写反応にOligo dT Primer、Random 6 mers、R-1 Primerのいずれを用いた場合も、Control Primer F-1とR-1を用いたPCRで、462 bpの増幅産物が得られる。
