TB Green^® Premix Ex Taq™ GC (Perfect Real Time)

1. 下記に示すPCR反応液を調製する。
   

   ＜1反応あたり＞

   試薬	使用量	最終濃度
   TB Green Premix Ex Taq GC (2×)	10 μl	1×
   PCR Forward Primer (10 μM)	0.4 μl	0.2 μM*1
   PCR Reverse Primer (10 μM)	0.4 μl	0.2 μM*1
   template (＜100 ng)	2 μl	*2
   滅菌精製水	7.2 μl
   Total	20 μl

   *1 最終primer濃度は0.4 μMで良い結果が得られる場合が多いが、反応性に問題がある時は0.2～1.0 μMの範囲で最適な濃度を検討すると良い。

   *2 template溶液中に存在するターゲットのコピー数により異なる。段階希釈して適当な添加量を検討する。DNA template 100 ng以下を用いることが望ましい。また、RT-PCRでcDNA (RT反応液) をtemplateとして添加する場合は、添加量をPCR反応液容量の10％以下とする。




2. PCRキャピラリーを遠心機で軽く遠心後、LightCyclerにセットし、反応を開始する。
   PCR反応は、下記のシャトルPCR標準プロトコールで行うことをお勧めします。まずはこのプロトコールを試し、必要に応じてPCR反応条件を至適化する。PCR条件を至適化する場合は下記の「PCR条件について」を参照してください。
   
   ＜Light Cycler＞
   
   
   Stage 2：PCR反応

   シャトルPCR標準プロトコール
   
   　　Stage 1：初期変性
   　　　　95℃　　30秒 20℃／秒
   　　　　1サイクル
   
   　　Stage 2：PCR反応
   　　　　95℃　　10秒　20℃／秒
   　　　　60℃　　30秒　20℃／秒
   　　　　40サイクル
   
   　　Stage 3：融解曲線分析
   　　　　95℃　　 0秒　20℃／秒
   　　　　65℃　　15秒　20℃／秒
   　　　　95℃　　 0秒　0.1℃／秒
   
   
   ＜ LightCycler 480 システム＞
   シャトルPCR 標準プロトコール
   Denature
   95℃ 30 秒 (Ramp Rate 4.4℃/sec.)
   1 サイクル
   PCR
   Analysis Mode：Quantification
   95℃ 5 秒 (Ramp Rate 4.4℃/sec.)
   60℃ 30 秒 (Ramp Rate 2.2℃/sec., Acquisition Mode : Single)
   40 サイクル
   Melting
   Analysis Mode：Melting Curves
   95℃ 5 秒 (Ramp Rate 4.4℃/sec.)
   60℃ 1 分 (Ramp Rate 2.2℃/sec.)
   95℃ (Ramp Rate 0.11℃/sec., Acquisition Mode : Continuous, Acquisitions : 5 per℃)
   1 サイクル
   Cooling
   50℃ 30 秒 (Ramp Rate 2.2℃/sec.)
   1 サイクル
   
   

   ※使用上の注意 本製品に使用しているTaKaRa Ex Taq HS はポリメラーゼ活性を抑制する抗Taq抗体を利用したホットスタートPCR用酵素です。他社の化学修飾タイプのホットスタートPCR酵素で必要なPCR反応前の95℃ (5～)15分の活性化ステップは行わないで下さい。必要以上の熱処理を加えると酵素活性が低下し、増幅効率、定量精度に影響を及ぼす傾向があります。 PCR反応前に鋳型の初期変性を行う場合でも、通常95℃ 30秒で充分です。




3. 反応終了後、増幅曲線と融解曲線を確認し、定量を行う場合は検量線を作成する。
   解析方法は、リアルタイムPCR装置の取扱説明書をご参照ください。

PCR条件について