Anti-Human Procollagen Type I C-peptide (PIP)を用いたウェスタンブロッティング
（大阪歯科大学 秋山真理先生のご好意により掲載）
使用抗体
Anti-Human Procollagen Type I C-peptide (PIP) (Clone PC5-5)（製品コード M011）
（本製品は、ヒト抗原だけではなく、ウシ抗原も検出が可能です。）
Anti-bovine collagen type I Antibody（Abcam社）
（本製品は、ヒト抗原だけではなく、ウシ抗原も検出が可能です。）
Anti-bovine collagen type I Antibody（Abcam社）
方法
ウシ骨膜細胞（Bovine periosteal cells）の培養時に分泌される細胞外マトリックスの成分を調べるために、アスコルビン酸を含有または不含の培地で培養を行い、細胞上清を回収した。
培養3、4、5週目の細胞上清を、ProteoExtract Protein Precipitation Kit（製品コード 539180-1KIT）を用いて調製し、電気泳動用サンプルバッファー（Laemlli sample buffer）に溶解した。（Anti-Human Procollagen Type I C-peptide (PIP)を用いる場合は、非還元非加熱の条件でサンプルを調製した。）
各20 μg分のサンプルについて、SDS-PAGE（7.5%）を行い、メンブレンにブロッテイングした。
このメンブレンを用いて、一次抗体1000倍希釈液を一晩反応させ、二次抗体は、Envision Polymer（DAKO社）50倍希釈液を反応させ、ウェスタンブロッテイングを行った。検出は化学発光で行った。
培養3、4、5週目の細胞上清を、ProteoExtract Protein Precipitation Kit（製品コード 539180-1KIT）を用いて調製し、電気泳動用サンプルバッファー（Laemlli sample buffer）に溶解した。（Anti-Human Procollagen Type I C-peptide (PIP)を用いる場合は、非還元非加熱の条件でサンプルを調製した。）
各20 μg分のサンプルについて、SDS-PAGE（7.5%）を行い、メンブレンにブロッテイングした。
このメンブレンを用いて、一次抗体1000倍希釈液を一晩反応させ、二次抗体は、Envision Polymer（DAKO社）50倍希釈液を反応させ、ウェスタンブロッテイングを行った。検出は化学発光で行った。
結果
アスコルビン酸を含有する培地で培養した培養上清では、Procollagen Type I C-peptide（PIP）抗体およびCollagen I抗体を用いて目的バンドの検出ができた。
出版社の許可を得て、参考文献より転載
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A：Anti-bovine collagen type I Antibody B：Anti-Human Procollagen Type I C-peptide (PIP) |
参考文献
- Cell Transplantation, (2009);18, 443-452.
Akiyama, M. and Nakamura, M.
Bone Regeneration and Neovascularization Processes in a Pellet Culture System for Periosteal Cells
