Synthetic siRNA Quantitation Kit

Synthetic siRNA Quantitation Core Kitによる合成si RNA定量操作フロー

Synthetic siRNA Quantitation Kit（製品コード 6142）

※必ず、説明書をご確認の上、操作を行ってください。

dATPを5 μlずつ反応チューブに分注し、1反応あたり5 μlの合成siRNAサンプル（total RNA、合成siRNA希釈液など）を添加する
↓
75℃、5分（サンプル熱変性）
↓
氷上で急冷
↓
【Master Mix】
＜1反応あたり＞
Terminal Transferase Buffer13 μl
Recombinant RNase Inhibitor1 μl
Terminal Transferase1 μl
↓
1反応あたりMaster Mixを15 μlずつ熱変性済みサンプルに添加する
（サンプル間のコンタミネーションに気をつける）
↓
37℃、30分（poly dA tailing反応）
4℃
↓
Oligo dT Primerを5 μlずつ反応チューブに分注し、1反応あたり5 μlのpoly dA tailing反応液を添加する
↓
75℃、5分（Oligo dT Primerアニーリング）
↓
【Master Mix】
＜1反応あたり＞
RT Buffer9 μl
RT Enzyme Mix1 μl
↓
1反応あたりMaster Mixを10 μlずつアニーリング反応液に添加する
（サンプル間のコンタミネーションに気をつける）
↓
42℃、15分（逆転写反応）
85℃、5秒（逆転写酵素を熱失活させる）
4℃
↓
鋳型DNA
↓
リアルタイムPCR
(Thermal Cycler Dice Real Time System使用)
↓
TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus）
【Master Mix】
＜1反応あたり＞
滅菌精製水8.5 μl
Universal Primer（10 μM）1 μl
siRNA qPCR Primer（10 μM）1 μl
TB Green Premix Ex Taq II（2×）12.5 μl
↓
Master Mixを23 μlずつ反応チューブに分注し、1反応あたり2 μlの逆転写反応液を添加する
↓

反応を開始する
Pattern 1： （初期変性）
　　Hold 　　95℃、30秒
Pattern 2： PCR反応
　　Cycles： 40
　　95℃、5秒
　　60℃、30秒
Pattern 3： Dissociation
↓
反応終了後、解析を行う

  Synthetic siRNA Quantitation Kit