投与した合成siRNAの残存量を測定
- total RNA中のsiRNAをインターカレーター法のリアルタイムPCRで簡便に定量
- 3' dTTオーバーハングをもつsiRNAのみを特異的に測定
- 106コピーから検出可能
製品説明
動物や細胞にsiRNAを投与しRNA干渉による特定遺伝子のノックダウン効果を検証することにより、医薬品としてのsiRNAの利用が検討されている。
本製品は合成siRNAの定量を目的としたコアキットで、リアルタイムPCR解析と組み合わせることにより、投与した合成siRNAの残存量を、細胞、組織、血液などから抽出したtotal RNAをサンプルとして測定することができる。
siRNAを化学合成する際には、一般的に3’末端にデオキシチミン（dT）2塩基のオーバーハングを付加する。本製品では、この3’オーバーハングにポリデオキシアデニン（ポリdA）を付加した後、特別に設計したOligo dT Primerを用いて逆転写反応を行うことにより、total RNA存在下でも合成siRNA分子から相補的なcDNAを調製することができる。調製されたcDNAを鋳型として、TB Green Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）（製品コード RR820S/A/B）などを用いたインターカレーター法のリアルタイムPCRを行うことにより、合成siRNAの高感度な定量を行う。
Synthetic siRNA Quantitation Kit (with TB Green Premix Ex Taq II Tli)（製品コード RR861A）は、本製品（製品コード 6142）とTB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)（製品コード RR820A）のセット品である。
本製品は合成siRNAの定量を目的としたコアキットで、リアルタイムPCR解析と組み合わせることにより、投与した合成siRNAの残存量を、細胞、組織、血液などから抽出したtotal RNAをサンプルとして測定することができる。
siRNAを化学合成する際には、一般的に3’末端にデオキシチミン（dT）2塩基のオーバーハングを付加する。本製品では、この3’オーバーハングにポリデオキシアデニン（ポリdA）を付加した後、特別に設計したOligo dT Primerを用いて逆転写反応を行うことにより、total RNA存在下でも合成siRNA分子から相補的なcDNAを調製することができる。調製されたcDNAを鋳型として、TB Green Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）（製品コード RR820S/A/B）などを用いたインターカレーター法のリアルタイムPCRを行うことにより、合成siRNAの高感度な定量を行う。
Synthetic siRNA Quantitation Kit (with TB Green Premix Ex Taq II Tli)（製品コード RR861A）は、本製品（製品コード 6142）とTB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)（製品コード RR820A）のセット品である。
＜注意＞
本製品は、3’オーバーハングがデオキシチミンd（TT）である合成siRNAの定量に使用できる。
3’オーバーハングとしてd（TT）以外のDNA配列が付加された合成siRNAの場合、配列を変更したOligo dT Primerを別途用意すれば、本製品を使用できる。
3’オーバーハングの付加がない、または3’オーバーハングがRNAである合成siRNAの場合は、本製品を使用できない。
内容
（30反応分）*1
| 1. | Terminal Transferase Buffer | 390 μl |
| 2. | Terminal Transferase | 30 μl |
| 3. | dATP | 150 μl |
| 4. | Recombinant RNase Inhibitor | 30 μl |
| 5. | Oligo dT Primer *2 | 150 μl |
| 6. | RT Buffer | 270 μl |
| 7. | RT Enzyme Mix | 30 μl |
| 8. | Universal Primer（10 μM） | 120 μl |
| 9. | EASY Dilution（for Real Time PCR） | 1 ml |
| 10. | Control siRNA（20 nM） | 10 μl |
| 11. | Control Primer（10 μM） | 20 μl |
| *1 | poly dA tailingおよび逆転写反応30反応分、リアルタイムPCR用Universal Primer 120反応分を含む。 |
| *2 | 本製品用に設計したOligo dT Primerである。 |
保存
－20℃
本製品以外に必要な試薬、機器（主なもの）
- リアルタイムPCR用増幅装置および専用チューブ、専用プレート
Thermal Cycler Dice Real Time System II（製品コード TP900:終売）
CronoSTAR 96 Real-Time PCR System（製品コード 640231/640232）
CronoSTAR Portable Real-Time PCR System（製品コード 640245/640247/640249）など - リアルタイムPCR 用siRNA配列特異的プライマー
- リアルタイムPCR 試薬
本製品と組み合わせ可能なリアルタイムPCR関連製品
TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)（製品コード RR820S/A/B）
TB Green Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus)（製品コード RR420S/A/B） - 0.2 mlマイクロチューブ（PCRチューブ）
- マイクロピペットおよびチップ（オートクレーブ処理したもの）
- RNA抽出キット（RNAiso Plus（製品コード 9108/9109）など）
原理
合成siRNAからのcDNA調製
- poly dA tailing反応
合成siRNAを熱変性により一本鎖にし、合成siRNAの3’末端に付加されているデオキシチミンd（TT）にポリdAを付加する。
- 逆転写反応
付加されたポリdA配列にOligo dT Primerをアニーリングさせた後、逆転写反応を行う。
このOligo dT Primerには、後のリアルタイムPCRを行う際に利用されるUniversal配列が付加されている。
＜注意＞ 本製品のOligo dT Primerは、3’オーバーハングがd (TT)である合成siRNA用に設計されたものです。3’オーバーハングとしてd (TT)以外のDNA配列が付加されたsiRNAの場合、配列を変更したOligo dT Primerを別途用意する必要がある。配列については、弊社テクニカルサポートラインまでお問い合わせください。
リアルタイムPCRによる定量
調製されたcDNAを鋳型として、TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)＊1（製品コード RR820S/A/B）を用いてリアルタイムPCRを行う。
増幅にはUniversal Primer＊2とsiRNA 配列特異的プライマー＊1を使用する。TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) では、Hot Start PCR用酵素TaKaRa Ex Taq HSを使用しリアルタイムPCRを行うため、反応液調製時の非特異的増幅による影響の少ない、高感度な定量PCRが可能である。
*1 別途用意する。
*2 本製品に含まれている。
調製されたcDNAを鋳型として、TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)＊1（製品コード RR820S/A/B）を用いてリアルタイムPCRを行う。
増幅にはUniversal Primer＊2とsiRNA 配列特異的プライマー＊1を使用する。TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) では、Hot Start PCR用酵素TaKaRa Ex Taq HSを使用しリアルタイムPCRを行うため、反応液調製時の非特異的増幅による影響の少ない、高感度な定量PCRが可能である。
*1 別途用意する。
*2 本製品に含まれている。
Protocols
リアルタイムPCR用siRNA配列特異的プライマーの設計方法
Synthetic siRNA Quantitation Core Kitによる合成si RNA定量操作フロー
Application
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