NucleoBond^® Xtra Midi/Maxi

*低コピープラスミドの精製には、使用するバッファー量を増やす必要があるため、追加バッファーが必要です。NucleoBond Xtra Buffer Set I（製品コード 740417）をご利用ください。

1	培養液の調製 集菌	培養液のOD600を測定し、培養液の推奨液量を求める。 　培養液の液量（V）＝800/ OD600 (ml) 培養液を、4℃、4,500～6,000×gで10分間以上遠心し、上清を除去する。
2	菌の溶解	細胞ペレットを、Buffer RES（＋RNase A）*1 16 mlに完全に溶解する。 Buffer LYS 16 mlを細胞懸濁液に加え、穏やかに混合する。ボルテックスはしてはならない。 室温で、5分間静置する。
3	カラムの平衡化	カラムフィルターを挿入したNucleoBond Xtra Columnを、Buffer EQU 12 mlで平衡化する。 図に示すように、カラムの縁に沿ってバッファーを注ぐ。液を自然落下させてカラムを空にする。 フィルター全体が湿っていることを確認する。
4	中和	Buffer NEU 16 mlを、2の細胞懸濁液に加え、直ちに穏やかに混合する。ボルテックスはしてはならない。
5	ライセートの清澄化とローディング	4の溶液が入ったチューブを3回反転して沈殿が均一に懸濁している状態にした後、フィルターに加える。 液を自然落下させてカラムを空にする。
6	カラムの洗浄（1回目）	Buffer EQU 5 mlでフィルターとカラムを洗浄する。 図に示すようにカラムの縁に沿ってバッファーを注ぎ、フィルターに残っている溶液を確実に洗浄する。
7	カラムフィルターの廃棄	カラムからフィルターを引き抜く。あるいは、カラムを逆さにしてフィルターを除く。
8	カラムの洗浄（2回目）	Wash Buffer WASH 8 mlで、カラムを洗浄する。
9	溶出	Elution Buffer ELU*2 5 mlでプラスミドDNAを溶出する。 溶出液を15 ml遠心チューブ（各自で用意）に集める。
10	沈殿	イソプロパノール（室温）を3.5 ml加え、ボルテックスで十分混合した後、室温で2分間静置する。
NucleoBond Finalizerを用いた精製（所要時間：約5分）
11	沈殿のローディング	30 mlシリンジからプランジャーを抜き取り、出口にNucleoBond Finalizerを取り付ける。 沈殿混液をシリンジの中にいれ、プランジャーを挿入してFinalizerに通す。 流出液は廃棄する。
12	沈殿の洗浄	30 mlシリンジからFinalizerを取り外し、プランジャーを抜き取る。 Finalizerをシリンジの出口に再びとりつける。 70%エタノール2 mlをシリンジの中にいれ、プランジャーを挿入してエタノールを押しこみ、Finalizerに通す。 流出したエタノールは廃棄する。
13	膜フィルターの乾燥	30 mlシリンジからFinalizerを取り外し、プランジャーを抜き取る。 Finalizerを再びシリンジの出口に取り付ける。 残ったエタノールを飛ばすため、プランジャーを挿入して空気を押しこみ、Finalizerに通す。 エタノールが全く出てこなくなるまで、このステップを3回以上繰り返す。 （キムタオル等の上で、Finalizerの先からエタノールが出てこないことを確認する。）
14	DNAの溶出	30 mlシリンジからFinalizerを取り外す。 1 mlシリンジからプランジャーを抜き取り、Finalizerをシリンジの出口に取り付ける。 適量のBuffer TRIS（またはTE Buffer）200～800 μlをシリンジの中に加える。 Finalizerの出口を新しい回収チューブにセットし、プランジャーを挿入してプラスミドを溶出する。 1 mlシリンジからFinalizerを取り外し、プランジャーを抜き取る。 Finalizerをシリンジの出口に再び取り付ける。 最初の溶出液をシリンジに戻し、同じ回収チューブの中に再び溶出する。

*1	Buffer RES（＋RNase A）の調製法 RNase A（凍結乾燥品）のチューブに1 mlのBuffer RESを加えて完全に溶解し、全量をBuffer RESのボトルに移す。
*2	BACのようなサイズの大きなプラスミドを溶出する場合は、Elution Buffer ELUを50℃に加温しておくと、回収率が上がる。