LymphoONE™ T-Cell Expansion Xeno-Free Medium

A) 12 well plateへのAnti-CD3 mAb GMP grade（製品コード T210）とRetroNectin（製品コード T100A/B）のコーティング

1. Anti-CD3 mAb GMP grade（5 μg/ml）とRetroNectin（25 μg/ml）を含む血液保存液（ACD-A）、またはPBS溶液を調製する。12 well plate 1ウェルあたり4.5 ml（1.2 ml/cm²）必要となる。
2. 調製した溶液を12 well plateに4.5 ml/wellで添加する。
3. 37℃、5％ CO²インキュベーター内で5時間以上保温、または4℃ O/Nでコーティングする。
4. コート液を全量除去する。
5. 1 wellあたり5 mlのPBSを用いて3回洗浄する。
   ※最後の洗浄液は、PBMCを播種する直前に除去する。

B) PBMCの播種

1. 0～1％のヒト血清あるいは血漿を含むLymphoONE T-Cell Expansion Xeno-Free Mediumで1×10⁶ cells/mlのPBMC懸濁液を調製する。
2. Aでコーティング処理した12 well plateに、PBMC懸濁液を0.5 ml/well添加する。
3. 0～1％のヒト血清あるいは血漿を含むLymphoONE T-Cell Expansion Xeno-Free Mediumを4.5 ml/well添加し、さらにIL-2を終濃度200 U/ml（～1,000 U/ml）となるように添加する。
4. 37℃、5％ CO₂インキュベーター内で培養する。

C) 継代

1. 12 well plateの細胞培養液上清を約3 ml回収し、15 ml tubeに移す。
2. 12 well plateの細胞をピペッティングにより懸濁し、細胞懸濁液の全量を1．の15 ml tubeに加える。細胞が剥がれにくいため、20回以上ピペッティングしてよく懸濁する。
3. 顕微鏡でプレートに細胞がほとんど残っていないことを確認する。
4. T25 flaskに0～1％のヒト血清あるいは血漿を含むLymphoONE T-Cell Expansion Xeno-Free Mediumを6.9 ml添加する。
5. 15 ml tubeに回収した細胞液をよく懸濁し、T25 flaskに0.9 ml添加する。
6. IL-2を終濃度200 U/ml(～1,000 U/ml)となるように添加する。
7. 37℃、5％ CO₂インキュベーター内で、フラスコを立てて培養継続する。

D) 継代

1. 新しいT25 flaskにLymphoONE T-Cell Expansion Xeno-Free Mediumを7.8 ml添加する（血清、血漿は添加する必要無し）。
2. 培養7日目のT25 flaskより細胞液および培地の全量（7.8 ml）を回収し、1.で用意したT25 flaskに添加する。
3. IL-2を終濃度200 U/ml (～1,000 U/ml)となるように添加する。
4. 37℃、5％ CO₂インキュベーター内でフラスコを立てて培養継続する。