PicoPLEX^® WGA Kit

A1　他のWGA技術に比べ、PicoPLEX Single Cell WGA Kitの最大の特長は、シングルセルを使用した場合でも最も再現性の良い解析データが得られることです。また、この技術はバックグラウンドが非常に低いのも特長です。

A2　

• 1～10個のヒト細胞（割球、極体、栄養芽細胞、羊膜細胞、血中循環腫瘍細胞、培養細胞など）
• 1,000～10,000個の細菌細胞
• インタクトまたは断片化した一本鎖 ／二本鎖DNA
• 単離されたDNA（15～60 pgのヒトDNA）
  60 pg以上のインプットも可能ですが、各ステップでサイクル数の最適化が必要です。
• インプットサイズ　500 bp以上
• ソートした染色体

A3　シングルセルの割球、極体、栄養芽細胞、羊膜細胞、培養細胞由来のDNAが正常に増幅されています。

A4　 はい。細胞外のDNAや増殖培地の混入を抑えるために細胞を洗浄する必要があります。PBS（Ca^2＋、Mg^2＋、BSAフリー）で洗浄し、回収後の洗浄バッファーの持込は2.5 μl以下にすることを推奨します。

A5　 タカラバイオでは検証していませんが、一部のユーザー様はポリビニルアルコール（例えば0.1％ PVA）を含んだPBSを、細胞の洗浄／回収に使用され成功しています。洗浄／回収バッファーに用いるPBSは、Ca^2＋、Mg^2＋、BSAフリーのものを使用してください。

A6　 ソーティング、希釈およびマイクロマニピュレーションが適しています。

A7　 細胞を固定しないことと、細胞の分取・回収に光散乱または位相差を使用することを強く推奨します。分取に成功した細胞を顕微鏡／目視確認をすることで、分取条件を最適化できます。

A8　 PicoPLEX Single Cell WGA Kitのサンプルインプット液量は、1反応あたり5 μlです。但し、細胞およびバッファーの持ち込み量は最大2.5 μlです。

A9　 いいえ。PicoPLEX Single Cell WGA Kitは異なる技術を使用しています。

A10　 細胞の溶解からDNAの増幅まで3時間以内で完了し、5 μg以上の増幅産物が得られます。

A11　 PicoPLEX Single Cell WGA Kitは増幅自体よりも細胞分取の不確実性によって制限されますが、ソーティングで分取した培養細胞で約90％の増幅成功率が得られます。シングルセルからは、常に再現性のある高収量の増幅されたゲノムDNAが得られます。バッファーのみのネガティブコントロールからは、バックグラウンドがほとんど生じません。

A12　 はい。シングルセルを用いた反復実験で、qPCRのCtデータの相関係数は約0.9でした。

A13　 以下の第三者から入手したデータをご参照ください。

SNPジェノタイピング方法	シングルセル増幅成功率	SNPコール率	LOH
PCR	95％	＞95％	＜10％
Illumina Infinium SNP array	95％	50～60％	7～12％

A14　 はい。PicoPLEX Single Cell WGA Kitは単一コピーを増幅できる感度と高い特異性を持っています。

A15　 PicoPLEX Single Cell WGA Kitの増幅産物は一本鎖DNAと二本鎖DNAの混合物です。

A16　 PicoPLEX Single Cell WGA Kitは以下のアプリケーションで使用できます。

• コピー数多型（CNV）解析：オリゴアレイCGHでの解析
• SNPジェノタイピング
• PCRによる変異検出

PicoPLEX Single Cell WGA Kitは特にコピー数多型の解析に適しています。

A17　 PicoPLEX Single Cell WGA Kitは異なる細胞間でも同じ遺伝子座を再現性よく増幅するので、SNPジェノタイピングに適しています。他のWGA法で見られるドロップアウトやノイズが少なく、領域内に含まれるSNPを正確に検出します。

A18　 いいえ。PicoPLEX Single Cell WGA KitはゲルベースのSTRジェノタイピングには最適化されていません。

A19　 はい。増幅サイズが250 bp以下であれば使用できます。

A20　 ランダムプライム標識および化学標識です。

A21　 マイクロアレイにはアレイの説明書で推奨されている量から始め、さらに改善が必要な場合はDNA量を最適化することを推奨します。qPCRには5～200 ngの増幅DNAを使用することを推奨します。

A22　 いいえ。PicoPLEX Single Cell WGA Kitにはアダプターやバーコードが含まれていません。NGS解析で使用する場合は、増幅産物をライブラリー調製キットと一緒に使用する必要があります。（ThruPLEX DNA-Seq Kit（製品コード R400674ほか）など）

A23　 タカラバイオはこのアプリケーションをサポートしていませんが、推奨するDNA断片化サイズは以下の文献をご確認ください。

Reference	詳細
NGS analysis of PicoPLEX WGA-amplified single-copy sorted chromosomes to infer the haplotype of individual human chromosomes. Yang et al. PNAS (2011) 108, 12-17.	methodsセクションに詳細プロトコールあり
NGS analysis of single bacteria cells using PicoPLEX WGA amplification on microfluidic device. Leung et al. PNAS (2012) 109, 7665-7670.	methodは公開されず結果のみ

A24　PicoPLEX Gold Single Cell DNA-Seq Kit（製品コード R300669ほか）はイルミナ社NGS装置で使用できます。