In-Fusion簡易プロトコールによる2断片の同時クローニング
方法
In-Fusion HD Cloning Kit w/Cloning Enhancer（製品コード 639633）を用いて、インバースPCRで増幅したベクター2.7 kbに1 kbと2 kbのPCR増幅断片を連結させるIn-fusion反応をStandard ProtocolとQuick Protocolで行った。各DNA断片のPCR増幅にはPrimeSTAR Max DNA Polymerase（製品コード R045A）を使用した。形質転換にはE. coli HST08 Premium Competent Cells（製品コード 9128）を使用した。
Standard Protocol
CE treatment
PCR product 5 μl
Cloning Enhancer 2 μl
In-Fusion reaction
Cloning Enhancer 2 μl
37℃ 15 min
80℃ 15 min
80℃ 15 min
| 5× In-Fusion Reaction Premix | 2 μl |
| CE treated Vector | 1 μl |
| CE treated Insert | 1＋1 μl |
| dH2O (as needed) | 5 μl |
| Total volume | 10 μl |
50℃ 15 min
Quick Protocol
CE treatment and In-Fusion reaction
| 5× In-Fusion Reaction Premix | 2 μl |
| CE treated Vector | 1 μl |
| CE treated Insert | 1＋1 μl |
| Croning Enhancer | 1 μl |
| dH2O (as needed) | 4 μl |
| Total volume | 10 μl |
37℃ 15 min
50℃ 15 min
50℃ 15 min
結果
In-Fusion HD Cloning Kit w/Cloning Enhancerを用いて、正確性が極めて高いPrimeSTAR Max DNA PolymeraseでPCR増幅したDNA断片を、そのまま、1チューブで30分（37℃15分、50℃15分）インキュベートして形質転換することで、ベクターに高効率に2断片を同時クローニングできた。
※Quick Protocol はベクター、インサートともPCR増幅されたDNA断片の場合に限り行うことができる。
| Protocol | CE treatment | In-Fusion | Insert | Colonies 1/5 plating | Insert check |
|---|---|---|---|---|---|
| Standard | 37℃ 15 min 80℃ 15 min | 50℃ 15 min | 1K＋2K | 256 | 10/10 |
| Quick | 37℃ 15 min 50℃ 15 min | 1K＋2K | 544 | 10/10 | |
※Quick Protocol はベクター、インサートともPCR増幅されたDNA断片の場合に限り行うことができる。
