NucleoSpin^® miRNA

Buffer MW2^*1、rDNase溶液^*2が添付の英文説明書に従って調製、希釈されていることを確認する。

組織サンプルの場合
30 mgまでの組織を用意し、それぞれの組織に適した方法で細分化処理を行う。
（例）液体窒素を加え、凍結しながら乳鉢で粉状にする、など。

細胞サンプルの場合
10⁷個までの培養細胞を遠心で回収する。または、ディッシュ上で直接溶解する場合は、ディッシュ上の培地を出来る限り吸引除去する。

組織、または細胞にBuffer ML 300 μlを添加して、5回以上のピペッティングまたはvortexにより溶解する。
室温で5分間静置する。

NucleoSpin Filter（紫色のリング）をCollection Tube（2 ml：蓋付）にセットする。
1.のライセートをNucleoSpin Filterに加え、11,000×g、1分間遠心する。
NucleoSpin Filterを取り除く。

ろ液300 μl^*4に対してエタノール150 μlを添加する。すぐにvortexで5秒間混合する。
室温で5分間静置する。
（エタノール添加後、凝集物が見える場合もスピンダウンは行わず、すべて4.のカラムに添加する。）室温で5分間静置する。

NucleoSpin RNA Column（青色のリング）をCollection tube（2 ml：蓋付）にセットする。
3.の溶液をカラムに添加し、11,000×g、1分間遠心する^*5。
この操作でlarge RNAとDNAがNucleoSpin RNA Columnに吸着する。small RNAとタンパク質はろ液に含まれる。

カラムを新しいCollection tube（2 ml）にセットする。
Buffer MDB 350 μlをカラムに添加する。
11,000×g、1分間遠心した後、ろ液を捨て、同じチューブにカラムをセットする。

rDNase溶液^*2 100 μlをカラムに添加する。蓋を閉めずに室温で15分間以上反応させる。
（10．カラムへの吸着へ）

4.のろ液にBuffer MP 300 μlを加え、蓋を閉めて、vortexで5秒間混合する。

11,000×g、3分間遠心してタンパク質を沈殿させる。^*6

NucleoSpin Protein Removal Column（白色のリング）をCollection tube（2 ml：蓋付）にセットする。
上清をカラムに添加し、11,000×g、1分間遠心する。

NucleoSpin Protein Removal Columnを取り除き、800 μlのBuffer MXを添加する。
すぐにvortexで5秒間混合する^*7。
（Buffer MXの添加後、凝集物が見える場合もスピンダウンは行わず、すべて10.のカラムに添加する。）

Large RNAを結合済みの6のNucleoSpin RNA Column（青色のリング）に9.の溶液600 μlを添加し、11,000×g、30秒間遠心する
（rDNase溶液添加された状態のカラムに9の溶液を加えること）。ろ液を捨て、同じチューブにカラムをセットする。
この操作を繰り返し、すべての9.の溶液をカラムに加える。

1回目の洗浄
Buffer MW1 600 μlをカラムに添加する。
11,000×g、30秒間遠心した後、ろ液を捨て、同じチューブにカラムをセットする。

2回目の洗浄
Buffer MW2^*1 700 μlをカラムに添加する。
11,000×g、30秒間遠心した後、ろ液を捨て、同じチューブにカラムをセットする。

3回目の洗浄
Buffer MW2^*1 250 μlをカラムに添加し、11,000×gで2分間遠心して、カラムを乾燥させる。

カラムを新しいCollection tube（1.5 ml）にセットする。
RNase-free H₂O 30～100 μl^*8 をカラムに加え、蓋を閉めずに室温で1分間静置する。
蓋を閉めて11,000×gで30秒間遠心してRNAを溶出する。