レジオネラ属菌検査　生菌検出法（LC EMA-qPCR法）

検討：

BCYEα寒天培地で30℃、4日間培養したLegionella pneumophila血清群1（長崎80-045株）を滅菌生理食塩水に懸濁、希釈し、約10⁶～10^-1 CFU/mLの10倍希釈系列の菌液を調製した。各希釈菌液をWYOα寒天培地に100 μLずつ塗布し、37℃、7日間培養し生菌数を測定した。同時に、各希釈菌液を以下の検出方法の1,000倍濃縮液として用い、LAMP法及びLC EMA-qPCR法を行った。さらに、LC EMA-qPCR法における死菌検出抑制効果を確認するため、各希釈菌液を95℃、5分間加熱して作製した死菌液を用いて同様にLC EMA-qPCR法を実施した。

方法：

• LAMP法
  Loopampレジオネラ検出キットE（栄研化学）を用い、リアルタイム濁度測定装置（栄研化学）で測定を行った。なお、添付文書ではDNA抽出に検水の5,000倍濃縮液を用いるところを、本研究では検体調製の都合上、1,000倍濃縮液を用いた。それ以外の手順は添付文書に従った。
• LC EMA-qPCR法
  検水の1,000倍濃縮液100 μLに等量の酸処理液（0.2 M KCl-HCl, pH2.2）を加え、室温で5分間静置後、MWY液体培地900 μLを加え36℃、18時間培養した。培養後の培養液を用い、EMA処理、DNA抽出及びqPCRを順次実施した。EMA処理、DNA抽出、qPCRにはそれぞれViable Legionella Selection Kit for LC EMA-qPCR（タカラバイオ）、Lysis Buffer for Legionella（タカラバイオ）、Cycleave PCR Legionella（16S rRNA） Detection Kit（タカラバイオ）の各キットを添付文書に従い使用した。リアルタイムPCR装置は、StepOnePlus™リアルタイムPCRシステム（Life Technologies）を使用した。
  また、液体培養前後及びEMA処理前後の遺伝子検出の変化を観察するため、液体培養前（0hLC）及び液体培養後（18hLC）時点の検体についても同様にDNA抽出及びqPCRを実施した。

結果:

Legionella pneumophila 血清群1（長崎80-045株） 菌液を用いた各検査法の結果を表1に示す。
LAMP法では生菌数6.3×10¹ CFU/100 mL以上の菌液でレジオネラ属菌遺伝子が検出された。
一方、LC EMA-qPCR法では、生菌数6.3 CFU/100 mL以上の菌液でレジオネラ属菌遺伝子が検出された。また、各菌液において液体培養の前後で、遺伝子定量値にそれぞれ2～3オーダーの増加がみられた。死菌液では推定死菌数6.3×10² CFU/100 mL以下の菌液では死菌由来遺伝子の検出が完全に抑制された。

また、生菌数(CFU/100 mL)と遺伝子定量値(コピー/mL)の間には良好な相関が得られた（図1）。

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※大量の死菌が存在する場合などはEMAが消費され死菌由来遺伝子を検出する場合があります。

【本検討に用いた試薬】
Viable Legionella Selection Kit for LC EMA-qPCR（製品コード 7730／7730S）
Lysis Buffer for Legionella（製品コード 9181）
CycleavePCR Legionella (16S rRNA) Detection Kit（製品コード CY240／CY240S）