One Step PrimeScript™ III RT-qPCR Mix

簡易核酸抽出試薬により得られた粗抽出RNAのリアルタイムPCR解析例

One Step PrimeScript III RT-qPCR Mix（製品コード RR600A/B）およびOne Step PrimeScript III RT-qPCR Mix,with UNG（製品コード RR601A/B）は様々な反応阻害物質に対して高い抵抗性を示すため、簡易核酸抽出試薬によって得られた粗抽出RNA サンプルからの検出が可能である＊。ここでは、MightyPrep reagent for DNA（製品コード 9182）により粗抽出した核酸溶液を用いてリアルタイムPCR解析を行い、RNAターゲットを検出した実験例を紹介する。
＊ ただし、検出不能であった場合や、より精度の高い安定した解析結果を必要とする場合は、精製RNAサンプルを用いることをお勧めします。高純度total RNAの調製には、スピンカラムタイプのNucleoSpin RNA（製品コード 740955.10/.50/.250）やAGPC法の簡便化試薬であるRNAiso Plus（製品コード 9108/9109）が便利です。

I．培養細胞（K562細胞株）からの遺伝子発現解析

【方法】
簡易核酸抽出
  1. 1.5 mlマイクロチューブに100 μlのMightyPrep reagent for DNAを用意する。
  2. 20 μlの培養細胞懸濁液（e.g. 5×105 cells）を加える。
  3. チューブの蓋をし、ボルテックスでよく混合する。
  4. 95℃で10分加熱する。
  5. 12,000～15,000 rpmで2分間遠心する。
  6. 上清をRT-PCRの鋳型として使用する。

プライマー／プローブ検出領域
  • WT1遺伝子
  • GAPDH遺伝子

リアルタイムPCR反応液の調製
コンポーネント液量(μl)
One Step PrimeScript III RT-qPCR Mix または
One Step PrimeScript III RT-qPCR Mix, with UNG		12.5
Forward/Reverse Primers (各10 μM)各0.5
Takara qPCR Probe (10 μM)0.5
粗抽出核酸溶液1.0/2.5/5/10
RNase Free H2OX
合計25

リアルタイムRT-PCR反応
52℃
95℃
95℃
60℃
5 min.
10 sec.
5 sec.
30 sec.
40 cycles

【結果】
One Step PrimeScript III RT-qPCR Mix（製品コード RR600A/B）およびOne Step PrimeScript III RT-qPCR Mix, with UNG（製品コード RR601A/B）は、培養細胞から調製した粗抽出核酸溶液から、WT1遺伝子およびGAPDH遺伝子の発現を検出することができた。リアルタイムPCR反応系に添加する核酸粗抽出液量を増やしても（5 μlや10 μl）Ct値の上昇はほとんど無く、反応阻害物質への耐性が示唆された。

WT1遺伝子
粗抽出核酸溶液
　
GAPDH遺伝子
粗抽出核酸溶液

II．黄色ブドウ球菌の検出例

【方法】
簡易核酸抽出
  1. 1.5 mlマイクロチューブに100 μlのMightyPrep reagent for DNAを用意する。
  2. 滅菌済のマイクロピペットチップでプレート上の黄色ブドウ球菌コロニーを取り、1．で用意したMightyPrep reagent for DNAに懸濁する。
  3. チューブの蓋をし、ボルテックスでよく混合する。
  4. 95℃で10分加熱する。
  5. 12,000～15,000 rpmで2分間遠心する。
  6. 上清をRT-PCRの鋳型として使用する。
プライマー／プローブ検出領域
　　黄色ブドウ球菌rDNA

リアルタイムPCR反応液の調製
コンポーネント液量（μl）
One Step PrimeScript III RT-qPCR Mix12.5
Forward/Reverse Primers (各10 μM)各0.5
Takara qPCR Probe (10 μM)0.5
粗抽出核酸溶液1.0/2.5/5/10
RNase Free H2OX
合計25

リアルタイムRT-PCR反応
反応条件1（逆転写反応無し、図中No RT）
95℃
95℃
60℃
10 sec.
5 sec.
30 sec.
40 cycles

反応条件2（逆転写反応有り、図中RT 5 min）
52℃
95℃
95℃
60℃
5 min.
10 sec.
5 sec.
30 sec.
40 cycles

【結果】
One Step PrimeScript III RT-qPCR Mixは粗抽出核酸溶液から、黄色ブドウ球菌を検出することができた。また、逆転写反応を行うことにより、検出感度の向上が確認できた。

粗抽出核酸溶液
結果

製品情報

製品コードTaKaRa
Code		製品名容量価格
（税別）
RR600A/BRR600A/BOne Step PrimeScript III RT-qPCR Mix40回￥15,000
RR601A/BRR601A/BOne Step PrimeScript III RT-qPCR Mix, with UNG40回￥16,000
91829182MightyPrep reagent for DNA20 ml￥15,000

  One Step PrimeScript™ III RT-qPCR Mix