One Step PrimeScript™ III RT-qPCR Mix

• Thermal Cycler Dice Real Time System III（製品コード TP950/TP970/TP980/TP990）
• Applied Biosystems 7500Fast Real-Time PCR System（Thermo Fisher Scientific社）
• LightCycler 96 System（Roche Diagnostics社）
• CFX96 Real-Time PCR Detection System（Bio-Rad社）など

One Step PrimeScript III RT-qPCR Mix One Step PrimeScript III RT-qPCR Mix（製品コード RR600A　200回　25 μl反応系）

1. One Step PrimeScript III RT-qPCR Mix（2×）　　625 μl×4
   （RR601Aの場合One Step PrimeScript III RT-qPCR Mix, with UNG（2×）　　625 μl×4）
2. RNase Free Water　　1.25 ml×2
3. ROX Reference Dye（50×conc.）^＊　　100 μl
4. ROX Reference Dye II（50×conc.）^＊　　100 μl
＊ Applied BiosystemsのリアルタイムPCR装置など、ウェル間の蛍光シグナルの補正を行う装置を使用する場合に添加

ROX Reference Dyeを使用する機種

ROX Reference Dye（50×）

Applied Biosystems 7900HT/7300 Real-Time PCR System,
StepOnePlus Real-Time PCR System（Thermo Fisher Scientific社）

ROX Reference Dye II（50×）

Applied Biosystems 7500/7500 Fast Real-Time PCR System（Thermo Fisher Scientific社）

ROX Reference Dyeを使用しない機種

Thermal Cycler Dice Real Time Systemシリーズ
LightCycler/LightCycler 480 システム（Roche Diagnostics社）
CFX96 Real-Time PCR Detection System（Bio-Rad社）

• One Step RT-PCRによりRNAウイルスなどの解析を迅速かつ正確に行うことが可能である。
• 本製品は様々な反応阻害物質に対して高い抵抗性を示すため、多くの場合、簡易核酸抽出試薬による粗抽出RNAサンプルからの検出が可能である。
  ＊ ただし、検出不能であった場合、あるいはより精度の高い、安定した解析結果を必要とする場合は、純度の高いRNAサンプルを用いること。
  培養細胞や組織サンプルからの高純度total RNAの調製時の推奨製品：NucleoSpin RNA（製品コード 740955.10／.50／.250）およびRNAiso Plus（製品コード 9108／9109）
  
  
  

  ★ 反応阻害物質への耐性テスト

  ■ 添加なし	■ ヘマチン80 μM	■ ヘパリン0.125 U	■ メラニン 100 ng
  ■ フミン酸100 ng	■ タンニン酸 1,000 ng	※ 検出されず

  

  5種類の反応阻害物質を反応液に添加し、One Step PrimeScript III RT-qPCR Mix、従来製品および他社製品の阻害物質への耐性をテストした。One Step PrimeScript III RT-qPCR Mixは「添加なし」とのCt値の差が少なく、各種反応阻害物質への耐性が高いことが示された。
  鋳型RNA：Human HeLa Cell Total RNA
  ターゲット：Human ACTB遺伝子
  プローブ：Takara qPCR Probe

  

  Human HeLa Cell Total RNA 1 pg～100 ngを鋳型として、One Step PrimeScript III RT-qPCR Mixを用いてACTB、GAPDH、PPIA、YWHAZ遺伝子のマルチプレックス発現解析を行った。全ターゲットにおいて、R²＞0.99 を満たしていた。
  ○ Standard
  － Actin E = 97.1％ R²= 0.996 Slope=-3.393 y-int=33.278
  － YWHAZ E = 95.6％ R²= 0.997 Slope=-3.433 y-int=35.528
  － GAPDH E = 100.6％ R²= 1.000 Slope=-3.307 y-int=35.400
  － PPIA E = 97.1％ R²= 0.999 Slope=-3.395 y-int=33.800

  

  Human HeLa Cell Total RNA（製品コード 636543）、1 pg～1 μgを鋳型として、ACTB遺伝子の発現解析をOne Step PrimeScript III RT-qPCR Mix, with UNGを用いて、3日間に分けて行った。その結果、One Step PrimeScript III RT-qPCR Mix, ,with UNGは高い直線性（Rsq: 1）と安定した増幅効率（Eff. ≧92.5％）を示した。また、検量線間の各RNA量におけるCt値の最大差は1 pgにおける1.02が最大であった（データ示さず）。

• リアルタイムPCR装置
• 専用反応チューブあるいはプレート
• PCR用プライマー
• 検出用プローブ（TaKaRa qPCR Probeなど）
• マイクロピペットおよびチップ（オートクレーブ処理したもの）
• TaKaRa qPCR Probeについてはこちら
  プライマー・プローブ合成
  （TaKaRa qPCR Probe）

• One Step PrimeScript III RT-qPCR Mix (2×) を使用する際には、泡立てないよう穏やかに転倒混和し、試薬を均一にしてからご使用ください。試薬が完全に混和されていない場合、十分な反応性が得られなくなります。ボルテックスによる混合は行わないでください。なお、保存中に白濁を認めることがありますが、問題なくご使用いただけます。転倒混和により、必ず均一に混合し、チューブ蓋に付いている溶液を落としてからご使用ください（例：軽く遠心するなど）。使用後は、直ちにー20℃に保存してください。
  また、製品受け取り直後は凍結している場合がありますが、品質には問題がありませんので融解してご使用ください。
• 試薬の分注を行うときは必ず新しいディスポーザブルチップを用い、サンプル間のコンタミネーションを防止してください。
• 反応液は、必要分＋ α のMaster Mix（One Step PrimeScript III RT-qPCR Mix (2×)、 RNase Free H₂O、プライマー・プローブあるいはRNAサンプルの混合液）を調製すると便利です。組成の均等なMaster Mixを最少回数分注することで、試薬調製のばらつきを最小限に留めることができます。その結果、実験間のデータのばらつきも防げます。
• 本キットによる逆転写反応には、特異的なプライマーを用います。Random PrimerやOligo dT Primerは使用できません。