ThruPLEX^® DNA-Seq Kit

データご提供：理化学研究所 生命医科学研究センター　マイクロバイオーム研究チーム　梅山大地様

■実験の背景・目的

ゲノムの働き方を包括的に理解するためには、ゲノムDNAのどこに転写因子やヒストンなどのタンパク質が結合しているかを網羅的に明らかにする必要がある。これまで用いられてきたゲノムフットプリンティングというアプローチでは、細胞から単離した核に対してDNA分解酵素を働かせる方法などが用いられてきた。しかし、それらの方法は操作が難しく、核を単離する過程でタンパク質とDNAの相互作用が変化あるいは消失する危険性があった。そこで、我々は細胞膜透過性のDNAメチル化試薬であるジメチル硫酸（DMS）に着目し、新規のインビボフットプリント法であるDMS-Seq法の開発に取り組んでいる。プロトコールのさらなる高度化を目指して、タカラバイオ社のThruPLEX DNA-Seq Kitを用いたライブラリー化を行った。

■使用製品

製　品　名	容　量	製品コード
SMARTer ThruPLEX DNA-Seq Kit	24回	R400674

■実験ワークフロー

出芽酵母の培養液を集菌し、10⁸～10⁹の細胞懸濁液1 mlを2 mlチューブに分注
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30 μl DMSを加え、室温で2分インキュベート
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800 μlのin vivo STOP bufferを加え反応を停止し、細胞をwash bufferで2回洗浄
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Zymolyase処理とProK/SDS処理で細胞を溶菌し、フェノール／クロロホルム抽出とエタノール沈殿
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RNaseA処理、フェノール／クロロホルム抽出とエタノール沈殿
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12.5 μl超純水で復水し、50 ng DMS処理DNAを分取し、Putrescine/APE1処理
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ThruPLEX DNA-Seq Kitを用いたNGSライブラリー化
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MiSeqで75 bpペアエンドシーケンス
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Bowtie2でSaccharomyces cerevisiae S288C(R64-1-1)にマッピング

ワークフローの詳細は下記文献を参照ください。
Umeyama, T. et al. DMS-Seq for In Vivo Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions and Nucleosome Centers. Cell Rep. 22, 289-300 (2017)