1st strand cDNA合成反応
PrimeScript™ IV 1st strand cDNA Synthesis Mix（製品コード 6215A）
- 下記に示す反応液を氷上にて調製する。
＜1反応あたり＞試薬 使用量 5×PrimeScript IV cDNA Synthesis Mix 4 μl Random 6 mers（50 μM） ≦2 μl＊1＊2 鋳型RNA total RNA：≦5 μg
polyA＋ RNA：≦1 μgRNase Free dH2O X μl 20 μl - 穏やかに撹拌し、以下の条件で反応を行う。
30℃ 10分（Random 6 mers 使用時のみ）
42℃ 10～20分＊3 - 95℃、5分または70℃、15分で酵素を失活させた後、氷上で冷却する。＊4 *1 2 kb未満のcDNAを合成する場合は1～2 μl、2 kb以上のcDNAを合成する場合は0.4～1 μlのRandom 6 mersを反応液に添加することをお勧めします。Random 6 mers添加時には、反応の最初に30℃ 10分のプレヒートのステップを加えてください。
*2 Gene Specific Primerも使用可能です。その場合、最終濃度0.1 μMとなるように反応液に添加してください。
*3 PrimeScript IV RTaseは高次構造にも強い伸長性を示すので、通常の反応は42℃を推奨します。複雑な高次構造を持つRNAからcDNAを合成する場合、特に逆転写プライマーにGene Specific Primerを使用する場合に、逆転写反応温度を45～55℃にすることで改善が見られることがあります。
*4 長鎖cDNAを増幅する場合、cDNAへのダメージを避けるため70℃ 15分の失活操作を行ってください。
