レトロウイルスベクター作製

タカラバイオが開発した独自の手法（レトロネクチン拡大培養法、高純度NK細胞培養法およびレトロネクチン法）により、レトロウイルスベクターを用いて高純度NK細胞に対する遺伝子導入を行った。

＜実験方法＞

1. Day－7～Day7：レトロネクチン拡大培養法により、末梢血リンパ球（PBMC）からレトロネクチン誘導T細胞（RN-T細胞）の拡大培養を行った。
2. Day0：RN-T細胞をフィーダー細胞として用いた高純度NK細胞培養法により、PBMCからNK細胞培養を行った。
3. Day7～8：レトロネクチン法により、レトロウイルスベクターを用いて遺伝子導入を行った。
4. Day18～21：各種解析を実施した（図1、図2）。

図1.レトロウイルスベクターを用いて、がん胎児性抗原（CEA）を標的とする遺伝子を導入した高純度培養NK細胞の作製

2ドナー（Donor AとDonor Ｂ）のPBMCからタカラバイオ独自の手法により、高純度かつ高活性なNK細胞を培養後、CEAに対するキメラ抗原受容体（CAR）発現レトロウイルスベクターを用いて遺伝子導入を行い調製した遺伝子導入細胞（GMC）と遺伝子非導入細胞（NGMC）に対して、フローサイトメトリー（FCM）解析を行った。
FCM解析結果から、GMCおよびNGMC共にCD3^－CD56^＋比率約90％の高純度NK細胞が得られ（図1Ａ）、CD3^－CD56^＋GMCの90％以上は抗CEAを発現していた（図1B）。更に、CEA産生胃がん細胞株（MKN45）とGMC、NGMCを反応させ、抗腫瘍作用を持つサイトカインIFNγと脱顆粒マーカーCD107aを測定した結果、NGMCと比べてGMCはMKN45に対してより強く反応し、IFN-γとCD107a産生能は有意に亢進していた（図1Ｃ）。

図２. CEA産生量が異なるがん細胞株に対する抗CEA発現NK細胞の細胞傷害活性測定

CEA産生量が異なる3種類の胃がん細胞株を用いて、NK細胞の細胞傷害活性をカルセインアッセイにて測定した結果、抗CEA発現遺伝子導入NK細胞（GMC）はCEA産生量依存的に、遺伝子非導入細胞（NGMC）と比べてより強い細胞傷害活性を示した。