レトロウイルスベクター作製

• iPS細胞作製にもご利用いただけます
• 高効率遺伝子発現用プラスミドDNAまたは高発現遺伝子導入用プラスミドDNAを使用
• 安定発現細胞株作製も承ります

レトロウイルスゲノムからパッケージングシグナル（ψ）と両端のLTR配列を残し、目的遺伝子が挿入されたレトロウイルスベクターは、標的細胞の染色体に確実に目的遺伝子を挿入できるため、長期安定遺伝子発現が期待できます。本受託サービスでは、レトロウイルスの構造タンパク質であるgag-pol、envを発現するプラスミドと、組換えレトロウイルスゲノムmRNAを発現するプラスミドを宿主細胞に同時トランスフェクションすることによって一過性にレトロウイルスベクターを取得します。
gag-pol発現プラスミド、env発現プラスミド、およびレトロウイルスベクタープラスミドを同時トランスフェクションすることによって、細胞内で発現したgag-polタンパク質、envタンパク質、および組換えレトロウイルスゲノムRNAがアセンブルして組換えレトロウイルス粒子が出芽します。エンベロープ遺伝子はマウス、ラットに感染可能なecotropic-env、あるいはヒトを含む多くの哺乳動物細胞に感染可能なamphotropic-envから選択していただきます。トランスフェクションから48時間後の培養上清をフィルターろ過してレトロウイルスベクター液とし、小分け分注して納品いたします。

• レトロウイルスベクターを一過性に産生、ウイルスベクターを含む培養上清をろ過
• Retrovirus Titer Set (for Real Time PCR)を用いたリアルタイムPCR法によるウイルスベクター溶液中のウイルスRNAのコピー数を算出
  
  ※タカラバイオ取扱いベクター以外を使用する場合は、別途ご相談ください。
  ※標的とする細胞に適したウイルスエンベロープを選んでいただきます。マウス、ラット細胞への感染にはエコトロピックウイルスを、ヒトを含む多種の哺乳類細胞への感染にはアンフォトロピックウイルスを選択できます。
  ※ウイルスベクターの力価は、測定方法により異なります。また、ウイルスベクター液の組成、測定に使用する細胞や血清などの影響により、同じ方法であっても施設によって異なることがあります。ご了承ください。

• 目的の遺伝子を挿入した発現プラスミドDNA作製
• 挿入遺伝子のサイズ、挿入遺伝子（接続部位を含む）の塩基配列を確認
  ※pDON-AI-2 DNA、pMEI-5 DNAまたはpDON-5 vectorを使用します。

• ネオマイシン（G418）による薬剤選択後、薬剤耐性コロニーを検出し、感染力価を測定
  ※ネオマイシン耐性コロニー検出法の標的細胞には、マウスNIH/3T3細胞またはヒトHT1080細胞を使用いたします。ウイルス力価として得られる数値は、ウイルス液1 mlあたりのネオマイシン耐性コロニー形成能を示します（Neomycin colony forming unit/ml）。

• レトロウイルスベクターの作製
• 標的細胞のセットアップ、レトロウイルスベクターによる遺伝子導入
• 薬剤耐性となった目的遺伝子導入プール細胞の調製
• リアルタイムPCR法による目的遺伝子の発現確認

• ウイルスベクターの簡易濃縮（20～40倍濃縮）
• ウイルスベクターの恒常産生細胞の作製（プロデューサー細胞の作製）

• レトロウイルスベクター液　約10 ml×2種類、参考タイター 10⁹～10¹⁰ copies/ml
• 作業報告書

• 以下のフォーマットにご記入のうえ、電子メールにてこちらへご送付下さい。
  ※臨床検体由来細胞への導入をご要望の際は、ウイルス感染否定試験（HIV、HCV、HBV陰性）の結果をご提示下さい。
  • ウイルスベクター作製受託依頼書（Excel）
• 以下の手続きの後に実際のサービスを開始します。
  
  1. 挿入遺伝子に関する情報を開示ください。 ＜遺伝子情報書式用紙 ver.7＞
     タカラバイオの遺伝子組換え実験安全委員会への申請に必要な情報（遺伝子産物の性質、塩基配列等）をお知らせいただきます。
     電子ファイルに必要事項をご記載後、メールでお送りください。フラッシュメモリやCD-R等の媒体での郵送も受け付けます。
     なお、配列情報の郵送、メール送信の際には情報漏洩に充分ご注意ください。（弊社では責任を負いかねます）
     情報の扱いには十分注意を払っております。また、情報開示にあたり、秘密保持契約を必要とされる場合はご用意いたします。
  2. タカラバイオの安全委員会において、開示いただいた遺伝子情報をもとに、必要とされる物理的封じ込めレベルを判断し、折り返しご連絡させていただきます。
     P1レベルで扱うことができない遺伝子の場合、サービスをお断りすることになります。

• レトロウイルスベクターの取り扱いは、挿入されている遺伝子の全塩基配列が既知で、かつ、その遺伝子が毒性あるいは病原性等を示さず安全であると判断できる場合に限りP2レベルで扱うことができます。本サービスでは、P2レベルで扱うことのできる場合のみ、ご依頼をお受けしています。
• お客様よりご提供いただいたサンプル・情報および納品物の複製物は、別途期限を定めている場合を除き、業務終了後3ヵ月を経過すると順次廃棄いたします。ご了承ください。