再生／細胞医療・遺伝子治療支援

上市されているAAV製剤において、全⾝投与のAAV必要量は1患者あたり10¹⁴〜10¹⁵ vg（vector genome）程度とされています。臨床試験や商業製造に必要なウイルスベクターを大量にかつ安定的に製造するためには、プロセス開発から商用生産までのスケーラブルな移行と培養機器の操作性の簡便さが重要なファクターとなるため、タカラバイオでは50～3,000 Lのバイオリアクターを導入しています。今回はプロセス開発に該当する50 Lのバイオリアクターを用い、弊社がAAV2をベースに開発したCereAAV^＊の製造例を紹介いたします。

【実験結果】

1. 1. 50 L スケールとFlaskを用いた浮遊系AAVの生産培養（上流工程）
   浮遊化HEK293細胞を起眠・拡大培養して50 Lのバイオリアクターに播種し、AAV産生用プラスミド3種（pAAV-ZsGreen1, pRC-Cere, pHelper）をThermo Fisher Scientific社のGibco AAV-MAX Transfection Kitを用いてトランスフェクションした。トランスフェクションの72時間後にLysis液にて細胞溶解し、CereAAVを回収してCrude培養物とした（図1）。Crude培養物のvg titerはデジタルPCR法を用いて測定した。同様の作業をFlaskスケールで並行して実施した。
   これらの結果より、50 L スケールでもFlaskと同等のvg titerのAAV産生が可能であり（図2）、AAV2をベースに開発したCereAAVにとって想定通りの収量であった。
   タカラバイオにて実装したバイオリアクターを用いることで、CereAAVの生産培養は「3.6×10¹⁵ vg/50 L → 1.4×10¹⁷ vg/2,000 L」の収量が期待できる。
   

   

   

2. 2. 50 L スケール培養物を用いたAAVの精製（下流工程）
   1.で生産したCrude培養物をフィルター処理にて清澄化後、AAV精製用レジンを用いたアフィニティークロマトグラフィーによる溶出画分を回収した。溶出画分を超遠心精製後、TFF膜を用いたバッファー交換、滅菌ろ過することで精製AAVを得た（図3）。各精製工程におけるvg titerはデジタルPCR法を用いて測定した。
   清澄化後（Clarification product）のTotal vg titerを100％とした場合、各精製工程での回収率を図4に示す。最終の精製AAV（Filtered TFF product）の回収率は約25％であった。
   

   

   

タカラバイオでは様々な遺伝子治療用ウイルスベクターを製造しており、浮遊系バイオリアクターを導入したことで、より幅広く大量製造プロセス開発～製造をサポートいたします。

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