下水疫学調査（下水サーベイランス）用リアルタイムPCRキット

【対象製品】
Respiratory syncytial virus Detection RT-qPCR Kit for Wastewater（製品コード RC384A）

【概要】
下水由来の精製核酸（6検体）を用い、シングルプレックスおよびマルチプレックスにより、RSウイルスA型（RSV-A）およびRSウイルスB型（RSV-B）の検出をおこなった。反応はN=2で実施した。

【結果】
RSV-Bにおいて、シングルプレックスおよびマルチプレックスのいずれにおいても、全てのサンプルでCt値が算出された。一方で、マルチプレックスではシングルプレックスと比較して蛍光値の低下が確認された。
RSV-AはシングルプレックスおよびマルチプレックスのいずれにおいてもCt値が算出されず、サンプルにおいてターゲット遺伝子が検出可能な濃度で存在していなかったと考えられる。


【考察】
本評価では、マルチプレックスにおけるRSV-Bの蛍光値低下はCt値算出に影響を与えなかったが、ターゲット濃度が低いサンプルにおいては、マルチプレックスにおける蛍光値の低下がCt値算出の有無に影響を与えるリスクが考えられる。

【方法】

• ウイルスの濃縮：PEG沈殿法
  
  1. 40 mlの下水検体にPEG8000およびNaClをそれぞれ終濃度10％、0.4 mol/Lとなるように添加し、混合する。
  2. 12,000×g 100分 4℃の条件で遠心する。
  3. 上清を除去する。
  4. 12,000×g 5分 4℃の条件で遠心する。
  5. 上清を除去する。
  6. 800 μlの滅菌水で沈殿物を懸濁する。
  ※従来法^＊の4℃での一晩の振とうおよびその後の遠心の工程を、手順2～5にて代用することにより作業時間を短縮しました。
  ＊公益社団法人日本水環境学会COVID-19タスクフォース発行「下水中の新型コロナウイルス遺伝子検出マニュアル」（2021年3月）


• 核酸精製
  濃縮液から140 μlを分取し、核酸抽出キットを用いて精製した。プロトコールに従いRNA抽出液60 μlを得ました。


• リアルタイムPCR反応組成：
  • シングルプレックス用：取扱説明書記載の通り。
  • マルチプレックス用：
    

    試薬		使用量（1反応当たり）
    RT-qPCR Mix 2 w/UNG	2×	12.5 μl
    RSV-A Primer/Probe	25×	1.0 μl
    RSV-B Primer/Probe	25×	1.0 μl
    RNase Free H2O		5.5 μl
    Template		5.0 μl
    Total		25.0 μl



• リアルタイムPCR装置：Thermal Cycler Dice Real Time System III (Cy5) with PC（製品コード TP990）


• リアルタイムPCR条件：
  

  25℃ 42℃ 95℃ 95℃ 56℃

  10 min. 5 min. 30 sec. 5 sec. 30 sec.

  45 cycles

※本データは、弊社との共同研究を通じて、国立大学法人山梨大学国際流域環境研究センター 原本英司教授よりご提供いただきました。