PrimeSTAR^® LongSeq DNA Polymerase

PrimeSTAR LongSeq DNA Polymeraseの特性：
PrimeSTAR LongSeq DNA Polymerase（製品コード R055S/A/B）は非常に高い特異性を持ち、プライマーのTm値が70℃以上であることが必要です。一般的なPCR酵素よりも高いTm値が求められるため、既存のプライマーが十分に高いTm値でない場合、良好な増幅が得られない可能性があります。そのため、プライマーの5’末端側を伸長し、プライマー長を長くすることでTm値を高くすることが推奨されます。
以下のように、「プライマー推奨設計方法」を基に検証を行いました。

プライマー推奨設計方法：

• 35 mer程度（Tm値＞70℃）を強く推奨
• Tm値が70℃以下の場合、3 Step PCRにしてアニーリング温度をTm値より5℃以上下げる
• マルチプレックスPCRではプライマーのTm値を合わせる
• 低いTm値のプライマーでは増幅が得られない可能性があるため、70℃以上、可能な限り74℃以上のTm値のプライマーを使用することを推奨
• 3’末端塩基にホスホチオエート修飾塩基を使用することで、良好な増幅が得られることがある

検証内容：

• プライマー：Tm値の低いプライマーの5’末端側を伸長し、Tm値44～77℃のプライマーを設計（図1）
• PCR条件：2 Step PCRまたは3 Step PCR（アニーリング温度はそれぞれ68℃および57℃）（図2）
• 鋳型：ヒトゲノムDNA（100 ng/50 μl反応系）
• ターゲット：β-globin 24 kb
• PCR装置：Clontech PCR Thermal Cycler GP（製品コード WN400）を使用

結果：
2 Step PCRではアニーリング温度を68℃に設定し、Tm値が69℃以上のプライマーを使用した場合に特異的な24 kbの長鎖増幅が確認されました。3 Step PCRにおいて、短いプライマーでは24 kbの長鎖増幅は確認できなかったものの、アニーリング温度を57℃に設定し、Tm値が62℃以上のプライマーを使用した場合に特異的な24 kbの長鎖増幅が確認されました。（図2）

図1．プライマー配列とTm値

図2．PCR条件と結果