Nanoporeシーケンサーにおけるカスタムプロトコールの紹介
Oxford Nanopore Technologies社の次世代シーケンサーは、長鎖DNAやRNAの塩基配列を高精度に解析できることが特長です。この次世代シーケンサー専用のDNAライブラリー作製キットであるRapid PCR Barcoding Kit 24 V14（Oxford Nanopore Technologies）は、1～5 ngといった少量のgDNAからPCRによる増幅を行い、2 kb以上の長鎖リードを得ることができます。今回、Rapid PCR Barcoding Kit 24 V14のオリジナルプロトコール（RPB_9191_v114_revF_11Dec2024）と、オリジナルプロトコールのライブラリー作製に使用するPCR用ポリメラーゼをPrimeSTAR LongSeq DNA Polymerase（製品コード R055S/A/B）に変更したプロトコールを比較しました。
●材料および方法
5 ngのヒトゲノムDNAをRapid PCR Barcoding Kit 24 V14（Oxford Nanopore Technologies）キットに含まれるFragmentation Mixを用いて断片化しました。その後、オリジナルプロトコールに記載のポリメラーゼもしくはPrimeSTAR LongSeq DNA Polymeraseを用いてPCR増幅を行いました。PrimeSTAR LongSeq DNA Polymeraseについては、時短プロトコールと長鎖伸長プロトコールの2パターンを実施しました（図1）。PCR産物をプールし、Rapid Sequencing adapterをライゲーションしてライブラリーを作製し、GridION （Oxford Nanopore Technologies）、R10.4.1 flow cells（Oxford Nanopore Technologies）を用いてNGS解析を行いました。
図1．解析ワークフロー
●結果
図2．各プロトコールのマッピング率(％)、リード長（N50）、カバレッジ（A）、GC bias plot（B）
（A）得られたシーケンスリードから、88万リードにダウンサンプリングし、各プロトコールのマッピング率(％)、リード長（N50）、カバレッジを算出しました。オリジナルプロトコールと比較して、時短プロトコールではPCR反応時間を短縮したにも関わらず、同程度以上のリード長（N50）が得られました。また、長鎖伸長プロトコールでは、オリジナルプロトコールと比較して、約30％長いリード長（N50）を得ることが出来ました。リード長の増加に伴いカバレッジも増加しました。
（B）各プロトコールにおける増幅の均一性を確認するためにGC bias plotを作成し評価しました。GC含量の高い領域もAT含量の高い領域も増幅を得意とするPrimeSTAR LongSeq DNA Polymeraseを用いたことで、オリジナルプロトコールと比較して、時短および長鎖伸長プロトコールともにGC含量による増幅の偏りが少ない結果となりました。
●材料および方法
5 ngのヒトゲノムDNAをRapid PCR Barcoding Kit 24 V14（Oxford Nanopore Technologies）キットに含まれるFragmentation Mixを用いて断片化しました。その後、オリジナルプロトコールに記載のポリメラーゼもしくはPrimeSTAR LongSeq DNA Polymeraseを用いてPCR増幅を行いました。PrimeSTAR LongSeq DNA Polymeraseについては、時短プロトコールと長鎖伸長プロトコールの2パターンを実施しました（図1）。PCR産物をプールし、Rapid Sequencing adapterをライゲーションしてライブラリーを作製し、GridION （Oxford Nanopore Technologies）、R10.4.1 flow cells（Oxford Nanopore Technologies）を用いてNGS解析を行いました。
図1．解析ワークフロー
●結果
A
B
図2．各プロトコールのマッピング率(％)、リード長（N50）、カバレッジ（A）、GC bias plot（B）
（A）得られたシーケンスリードから、88万リードにダウンサンプリングし、各プロトコールのマッピング率(％)、リード長（N50）、カバレッジを算出しました。オリジナルプロトコールと比較して、時短プロトコールではPCR反応時間を短縮したにも関わらず、同程度以上のリード長（N50）が得られました。また、長鎖伸長プロトコールでは、オリジナルプロトコールと比較して、約30％長いリード長（N50）を得ることが出来ました。リード長の増加に伴いカバレッジも増加しました。
（B）各プロトコールにおける増幅の均一性を確認するためにGC bias plotを作成し評価しました。GC含量の高い領域もAT含量の高い領域も増幅を得意とするPrimeSTAR LongSeq DNA Polymeraseを用いたことで、オリジナルプロトコールと比較して、時短および長鎖伸長プロトコールともにGC含量による増幅の偏りが少ない結果となりました。
●まとめ
時短プロトコール
時短プロトコールでは、PCR反応時間をオリジナルプロトコールの約100分から約40分短縮しながらも、リード長（N50）はオリジナルプロトコールと同等以上であり、GCバイアスも小さい結果が得られました。
長鎖伸長プロトコール
長鎖伸長プロトコールでは、PrimeSTAR LongSeq DNA Polymerase の高い特異性により、オリジナルプロトコールに比べてリード長（N50）を約30％伸ばすことができ、GCバイアスも小さくなりました。これにより、取得塩基配列量が増加しコストも低下します。
本検証の結果より、PCRを用いたロングリード解析においてPCR酵素の選択が重要であることが示唆されました。オリジナルプロトコールで用いるRapid PCR Barcoding Kit 24 V14 (Nanopore)にはPCR酵素が含まれていないため、別途PCR酵素を用意する必要があります。本検証で紹介した時短および長鎖伸長プロトコールは、PrimeSTAR LongSeq DNA Polymeraseを使用し、PCR反応条件を変更するだけで実施可能です。また、PrimeSTAR LongSeq DNA PolymeraseはTaq DNA Polymeraseの28倍といった高い正確性を持つPCR酵素でもあることから、本酵素を用いることで、ロングリードシーケンスを高い正確性と優れたコストパフォーマンスでゲノムワイドに実施することが可能となります。
時短プロトコールでは、PCR反応時間をオリジナルプロトコールの約100分から約40分短縮しながらも、リード長（N50）はオリジナルプロトコールと同等以上であり、GCバイアスも小さい結果が得られました。
長鎖伸長プロトコール
長鎖伸長プロトコールでは、PrimeSTAR LongSeq DNA Polymerase の高い特異性により、オリジナルプロトコールに比べてリード長（N50）を約30％伸ばすことができ、GCバイアスも小さくなりました。これにより、取得塩基配列量が増加しコストも低下します。
本検証の結果より、PCRを用いたロングリード解析においてPCR酵素の選択が重要であることが示唆されました。オリジナルプロトコールで用いるRapid PCR Barcoding Kit 24 V14 (Nanopore)にはPCR酵素が含まれていないため、別途PCR酵素を用意する必要があります。本検証で紹介した時短および長鎖伸長プロトコールは、PrimeSTAR LongSeq DNA Polymeraseを使用し、PCR反応条件を変更するだけで実施可能です。また、PrimeSTAR LongSeq DNA PolymeraseはTaq DNA Polymeraseの28倍といった高い正確性を持つPCR酵素でもあることから、本酵素を用いることで、ロングリードシーケンスを高い正確性と優れたコストパフォーマンスでゲノムワイドに実施することが可能となります。
