ssDNA-Seq Kit

ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）試料については貴重であることに加え、試料の保存状態により、極微量のDNAしか解析に用いることができないケースがあります。さらにFFPE試料に含まれるDNAにおいては、アダプターライゲーションやPCR効率が低下し、シーケンスライブラリー調製がしばしば困難となります。理由としては、ホルマリン固定や抽出過程で断片化しやすく、一本鎖DNA（ssDNA）や損傷・分解DNAが多く含まれることがあげられます。
そのため、FFPE試料由来DNAから良好なシーケンス結果を得るためには、極微量から安定して、DNA断片化の度合いに関係なく高品質なライブラリーを調製できることが望まれます。

異なる断片化の度合いのFFPE試料由来DNA（BioIVT）を用い、超音波破砕装置（Covaris）で断片化処理を行った後、各社キット（表1）のプロトコールに従いライブラリーを調製しました。得られたライブラリーは、NextSeq 2000シーケンサー（Illumina）でペアエンドシーケンス（2×150 bp）を行いました。

表1. 各社NGSライブラリー調製キットの特徴
ssDNAから解析が可能なA社とB社のキット、およびdsDNAのみを解析対象とする従来法のC社のキットを使用した。ssDNA-Seq Kit（製品コード NN0003/NN0004）は、極微量（10 pg）からライブラリーを調製可能であり、極微量な短鎖DNAに対応した唯一のライブラリー調製キットである。

図1．インプットDNAの断片化の度合いおよび各社キットのライブラリー収量
左: 異なる断片化の度合いのFFPE試料由来DNAについて、その断片化度合いをTakara FFPE DNA QC All-in-One Kit（製品コード NN0001）を使用したLong/Short比、およびTapeStation Genomic DNA（Agilent）を使用したDIN値として評価した。
右: それぞれの試料由来DNAを10 ng使用し、各社キット（表1参照）を使用してライブラリー調製を行った。ssDNA-Seq Kitは断片化の度合いに関係なくすべてのFFPE試料由来DNAにおいて、最も高いライブラリー収量を示した。

図2．Mapping率とDuplicate率の比較
リード数は合計100万リードにダウンサンプリングして揃えた後、Bowtie2でマッピングを行い、Picardで重複リードの検出を行った。アライメントにはGRCh38ヒトゲノム参照配列を使用した。
ssDNA-Seq KitにおいてはDNAの断片化の度合いに関係なく、すべてのFFPE試料由来DNAで97％以上の高いマッピング率を示し、dsDNAのみを対象としたライブラリー調製であるC社キットと同程度の重複率（1％未満）を示した（パネルa、b）。他社キットはDNAの断片化が進むにつれて、マッピング率が顕著に低下した。
ssDNA-Seq KitはDNAの断片化の度合いに左右されずライブラリーを調製でき、高品質なシーケンス結果を得ることが可能であることが分かる。

Mapping（％）：参照ゲノム配列にアライメントされたリードの割合を示す。アダプターダイマー（インサートDNAをもたず、アダプター配列同士が結合）などが多く含まれるライブラリーをシーケンスした場合、この数値が低下する。
Duplicate（％）：同じ配列のDNAフラグメントが複数回読み取られたリードの割合を示す。PCR増幅などにより、特定の分子が繰り返し読まれているものが多いとこの数値が高くなる。ヘテロ変異などを高感度に検出するためには、この数値は低い方が望ましい。

表2．ssDNA-Seq KitとA社キットのインプット量別性能比較 FFPE試料由来DNA（DIN: 4.9）を1,000 pg、100 pg、10 pg使用し、ssDNA-Seq KitおよびA社キットのプロトコールにそれぞれ従ってライブラリーを調製し、シーケンス結果を比較した。
ssDNA-Seq Kitは、いずれのインプットDNA量においても十分なライブラリー収量を得ることができた。さらに、A社キットよりも高い％Mapping、低い％Duplicateを示した。ssDNA-Seq Kitは広いインプットレンジに対応してライブラリーを調製でき、極微量10 pgからも高品質なシーケンス解析結果を得られることが示された。