G-Rex^®（ガス透過性培養システム）

本プロトコールは、G-RexとRetroNectinを用いた、高効率かつ再現性の高いCAR-T細胞作製法です。刺激・感染・培養の工程を1容器で完結できるため、操作性に優れ、製造工程の簡略化が可能です。

◆特長◆

• RetroNectin/CD3抗体刺激法またはCD3/CD28（TransActなど）刺激法に対応
• G-Rexによる高密度培養とガス交換効率の向上
• レンチウイルスベクターによる安定した遺伝子導入
• 培養工程がシンプル：刺激・感染を同日に実施、翌日に培地添加、10日後に回収

【準備：プレートコーティング】　RetroNectin/CD3抗体刺激

1. G-RexにACD-A液で調製したRetroNectinおよびCD3抗体を添加
   

   RetroNectin （1 mg/ml）	5.0 μl/cm2
   CD3抗体（1 mg/ml）	1.0 μl/cm2
   ACD-A液＊	up to 200 μl/cm2

2. 37℃で1時間以上インキュベートまたは4℃、オーバーナイトでコーティングする。
   37℃の場合、48時間以内に回収する。
3. Day 0、6．の工程で使用する。

【準備：プレートコーティング】　CD3/CD28刺激

1. G-RexにACD-A液で調製したRetroNectinを添加
   

   RetroNectin （1 mg/ml）	5.0 μl/cm2
   ACD-A液＊	up to 200 μl/cm2

2. 37℃で1時間以上インキュベートまたは4℃、オーバーナイトでコーティングする。
   37℃の場合、48時間以内に回収する。
3. Day 0、6．の工程で使用する。

＊ACD-A液の代わりに、生理食塩水、D-PBS（‐）なども使用可能です。

試薬必要量

	RetroNectin	CD3抗体	コーティング液 Total vol.
底面積	5.0 μl/cm2	1.0 μl/cm2	200 μl/cm2
2 cm2	10 μl	2 μl	0.4 ml
5 cm2	25 μl	5 μl	1 ml
10 cm2	50 μl	10 μl	2 ml
50 cm2	250 μl	50 μl	10 ml
100 cm2	500 μl	100 μl	20 ml
500 cm2	2,500 μl	500 μl	100 ml

【Day 0】 細胞調製とレンチウイルス感染

4. LymphoONE T-Cell Expansion Xeno-Free MediumにHuman AB Serum（終濃度：2％）とIL-2（終濃度：200 IU/ml）を添加する（以下、調製培地とする）。
5. 末梢血単核細胞（PBMC）から分離したT細胞（CD4^＋/CD8^＋細胞）を準備する。T細胞の分離は、使用する試薬のプロトコールに従うこと。
6. プレートコーティングで準備しておいたG-Rexからコーティング溶液を除去し、D-PBS(-)で洗浄する。
7. 調製培地でT細胞懸濁液を調製する。G-RexにT細胞を0.5×10⁶ cells/cm²で播種する。
8. MOIに基づき、必要量のレンチウイルスベクター（工程9．Day 0の播種液量^＊の20％以下を推奨）を添加する。
9. 底面積あたりの総液量を0.25～0.5 ml/cm²とする。
10. CD3/CD28刺激の場合、使用する試薬のプロトコールに従い、刺激ビーズ等を添加する。
    ※ RetroNectin/CD3刺激の場合、この工程は不要
11. 37℃ CO₂インキュベーターで培養を開始

（例）

	播種細胞数	Day 0の播種液量＊
底面積	0.5×106 cells/cm2	0.25～0.5 ml/cm2
2 cm2	1×106 cells	0.5～1 ml
10 cm2	5×106 cells	2.5～5 ml

Day 0の播種液量はMシリーズ、Well Plateいずれも共通。

【Day 2】 培地追加

12. G-Rexの最大培地容量まで調製培地を追加し、培養継続
    ＜培養条件＞
    Mシリーズ（10 ml/cm²）：10日間培養、培地交換なし
    Well Plate（4 ml/cm²）：12日間培養、2回の培地交換
    

    シリーズ	ガスメンブレン面積	培地容量	播種細胞数	回収細胞数
    6M	2 cm2	20 ml	1×106	60～80×106
    	5 cm2	50 ml	2.5×106	150～200×106
    	10 cm2	100 ml	5×106	200～400×106
    5M	5 cm2	50 ml	2.5×106	100～200×106
    10M	10 cm2	100 ml	5×106	200～400×106
    50M	50 cm2	500 ml	25×106	1～2×109
    100M	100 cm2	1,000 ml	50×106	2～4×109
    500M	500 cm2	5,000 ml	250×106	10～20×109
    24 Well Plate	2 cm2	8 ml	1×106	40～80×106
    6 Well Plate	10 cm2	40 ml	5×106	200～400×106

    ※ 回収細胞数は目安です。ご使用になる培地、細胞、遺伝子導入条件などで、増殖率は変動します。

【Day～10】 CAR-T細胞回収

13. インキュベーターから取り出し、細胞を回収。（Mシリーズ以外のG-Rexを使用される場合は、7日前後で一部培地交換することをお勧めします）
    Day10のCAR-TのFCM解析結果
    （Day0での播種液量: 0.25 ml/cm²、MOI 5、CD19-CARベクターを感染）
    

試薬

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