LVpro™ Packaging Mix with pLVproシリーズ

製品ご購入に際しては、添付の購入確認書に必要事項を記入の上、ご注文の際に弊社販売店までお渡しください。本確認書が添付されていない場合は製品の出荷ができませんのでご注意ください。
ご質問は下記へご連絡ください。

LVpro Packaging Mixは、レンチウイルスベクター調製に必要なコンポーネントを発現するプラスミドを最適な比率で混合し、パッケージングに必要なコンポーネントを最適な比率で発現するよう設計することで、高力価のレンチウイルスベクターを得ることを可能にした製品である。また、5’LTRのU3領域をCMVプロモーターに置き換えたtat非依存性の第3世代レンチウイルスベクターであるpLVproレンチウイルスベクタープラスミドと組み合わせて用いることで、HIV-1由来tatの発現なしにレンチウイルスベクターの作製が可能となっている。導入したいpLVproレンチウイルスベクタープラスミドとLVpro Packaging MixをLenti-X 293T細胞にコトランスフェクトすることで、LVpro Packaging MixよりHIV-1由来のGag、Pol、Revのレンチウイルスタンパク質と、VSV-Gエンベロープタンパク質が一過性に発現される。そして、pLVproレンチウイルスベクタープラスミドから転写された組換えウイルスRNAは完全なウイルス粒子の中に取り込まれる（図1）。この最適化されたLVpro Packaging MixとLenti-X 293T細胞（製品コード 632180）、さらに高効率トランスフェクション試薬TransIT-VirusGEN Transfection Reagent（製品コード MIR6700）もしくはTransIT-293 Transfection Reagent（製品コード MIR2700）の組み合わせにより、高いウイルス力価を有するレンチウイルスベクター液を取得することができ、多くの場合、取得したレンチウイルスベクター液を濃縮することなく、直接、標的細胞の感染に使用できる。
※LVpro Packaging MixとpLVSINレンチウイルスベクタープラスミド（製品コード 6181～6192）との組み合わせでは、レンチウイルスは取得できない。


図1．LVpro Packaging MixとLenti-X 293T細胞を用いたレンチウイルスの産生
LVpro Packaging Mixと目的遺伝子を挿入したpLVproレンチウイルスベクタープラスミドをコトランスフェクトする（ステップ1）と、対応する組換えレンチウイルスゲノムRNA転写物とウイルスパッケージングタンパク質が産生される（ステップ2）。組換えウイルスRNAゲノム上のパッケージング配列（Ψ）がパッケージングタンパク質に認識されると（ステップ3）、組換えウイルスRNAゲノムがパッケージングタンパク質に取り込まれてウイルスコアが形成され、コアが細胞膜に輸送される（ステップ4）。その場所で、コアはVSV-Gエンベロープタンパク質を含む細胞膜によって包まれる。成熟した感染性のビリオン（ウイルス粒子）が細胞から出芽し（ステップ5）、培地中に放出される。培地からウイルス粒子を回収する（ステップ6）。
回収したウイルス粒子は細胞への感染力を有しているが、感染した標的細胞内での複製・増殖に必要な複数の遺伝子を欠いている。ウイルスタンパク質を発現するために必要なプラスミドを複数用いているため、頻度の低い組換えが何度も起こらないと、複製能をもつウイルスは生成しない。

LVpro Packaging Mix（製品コード 6195）
　　LVpro Packaging Mix 60 回^＊1（140 μl×3）
　　＊1 100 mm dish使用の場合の回数です。
LVpro Packaging Mix (pLVpro-MSCV Vector)（製品コード 6962）
LVpro Packaging Mix (pLVpro-MSCV-EI Vector)（製品コード 6963）
LVpro Packaging Mix (pLVpro-EF1α Vector)（製品コード 6964）
LVpro Packaging Mix (pLVpro-MSCV-ZsGreen1 Vector)（製品コード 6965）
LVpro Packaging Mix (pLVpro-MSCV-EI-ZsGreen1 Vector)（製品コード 6966）
LVpro Packaging Mix (pLVpro-EF1α-ZsGreen1 Vector)（製品コード 6967）

製品コード 6962～6967 は、LVpro Packaging Mix（製品コード 6195）と各pLVpro Vector（製品コード 6956～6961）^＊2のセットです。
＊2 pLVpro Vectorは個別に販売していません。
　　容量：20 µg、濃度：0.5 µg/µl

本製品に含まれるプラスミドは、すべてアンピシリン耐性遺伝子を搭載しています。カナマイシン耐性遺伝子を発現するプラスミドについては、「テクニカルサポート 技術相談室」にお問合せください。

ZIP形式で圧縮しておりますが、StuffIt Expander等でも解凍できます。

• pLVpro-MSCVのシーケンスデータ（fasta形式のテキストファイル）
• pLVpro-MSCV-EIのシーケンスデータ（fasta形式のテキストファイル）
• pLVpro-EF1αのシーケンスデータ（fasta形式のテキストファイル）
• pLVpro-MSCV-ZsGreen1のシーケンスデータ（fasta形式のテキストファイル）
• pLVpro-MSCV-EI-ZsGreen1のシーケンスデータ（fasta形式のテキストファイル）
• pLVpro-EF1α-ZsGreen1のシーケンスデータ（fasta形式のテキストファイル）

パッケージング細胞

Lenti-X 293T Cell Line（製品コード 632180）
ウイルス生産に最適化されたHEK 293T由来細胞株であり、高いトランスフェクション効率を示す（Clontechniques, October 2008）。

試薬類

• 下記のうちいずれかのトランスフェクション試薬^＊1
  a. TransIT-VirusGEN Transfection Reagent（製品コード MIR6700）
  b. TransIT-293 Transfection Reagent（製品コード MIR2704）
  c. CalPhos Mammalian Transfection Kit（製品コード 631312）
• ポジティブコントロール用ベクター^＊2
d. pLVpro-MSCV-ZsGreen1 Vector（ポジティブコントロール用：製品コード 6965）
e. pLVpro-MSCV-EI-ZsGreen1 Vector（ポジティブコントロール用：製品コード 6966）
f.  pLVpro-EF1α-ZsGreen1 Vector（ポジティブコントロール用：製品コード 6967）
＊1 a, bは安定して高力価のレンチウイルスを取得するのに適しており、cは比較的安価にトランスフェクションを行うことができる。本製品を使用して高力価のレンチウイルスを取得するにはTransIT-VirusGEN Transfection Reagentの使用を推奨する。
＊2 d, e, fは蛍光タンパク質であるZsGreen1を発現するレンチウイルスベクタープラスミドであり、トランスフェクション効率の確認や、調製したレンチウイルスの生物学的力価を確認するためのポジティブコントロールとして使用するのに便利である。

力価測定

正確で再現性のある遺伝子導入のために、レンチウイルスストック液の力価測定を強く推奨する。Lenti-X qRT-PCR Titration Kit（製品コード 631235）は、qRT-PCRを利用した迅速・簡便な力価測定キットである（Clontechniques, January 2008; Quinn et al., 1997）。本キットではインターカレーター法のリアルタイムPCRによりウイルスRNAゲノムの存在量（RNAタイター）を調べることで、ウイルスストック液の力価を約4時間で測定できる。Lenti-X p24 Rapid Titer Kit（製品コード 632200）では、ELISA法を用いてウイルス上清中のp24キャプシドタンパク質の量を測定する。測定したp24キャプシドタンパク質量はウイルス力価と相関する。
また、Lenti-X GoStix Plus（製品コード 631280/631281）を用いると、ウイルス上清20 μlを使用して10分でレンチウイルスp24を検出してウイルス力価を簡易判定できる。ウイルス上清を回収するか、まだ培養を続けるかを判断するためにも有用である。

組換えレンチウイルスの精製

ウイルスを精製することで、遺伝子導入実験に悪影響を及ぼすおそれがある細胞夾雑物を除去することができる。Lenti-X Maxi Purification Kit（製品コード 631233/631234）は、クルードな上清から高純度レンチウイルスを精製するためのキットで、自然落下カラムを用いたプロトコールにより、インタクトで機能的なレンチウイルスを簡単、迅速、高効率で得ることができる。

組換えレンチウイルスの濃縮

Lenti-X Concentrator（製品コード 631231/631232）を用いると、超遠心を行わずにウイルス力価を100倍まで濃縮できる。濃縮されたレンチウイルスを用いることで高いMOIで標的細胞に感染できる。

組換えレンチウイルスの感染効率アップ

RetroNectin (Recombinant Human Fibronectin Fragment)（製品コード T100A/B）は組換えフィブロネクチン断片（CH-296）で、レトロウイルスやレンチウイルスによる遺伝子導入効率を大きく向上させることができる（Clontechniques, October 2008）。RetroNectinは、組織培養プレート（ノントリートメント）にコーティングすることで、ウイルスと細胞の両方が結合する基質となる。この基質にウイルスと細胞が同時に接着することにより、細胞とウイルスの接触が増大し、遺伝子導入が促進される。RetroNectinは、特に浮遊細胞（リンパ球やリンパ球細胞株など）や遺伝子導入が困難な細胞（造血幹細胞など）、あるいはポリブレンに特に弱い細胞に有用である。

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