CronoSTAR™ 96 Real-Time PCR Systemを用いる場合の操作方法
TB Green® Premix Ex Taq™ II FAST qPCR（製品コード RR830A/B）
CronoSTAR 96 Real-Time PCR Systemを用いる場合の操作方法
※各機種の取扱説明書に従って操作してください。
※各機種の取扱説明書に従って操作してください。
- 下記に示すPCR反応液を調製する。
＜1反応あたり＞
試薬 使用量 最終濃度 TB Green Premix Ex Taq II Fast qPCR (2X) 10.0 μl 1× PCR Forward Primer（10 μM） 0.8 μl 0.4 μM＊1 PCR Reverse Primer（10 μM） 0.8 μl 0.4 μM＊1 template（＜100 ng）＊2 ≦ 2.0 μl 滅菌精製水 x μl Total 20 μl ＊3 ＊1 最終プライマー濃度は0.4 μMで良い結果が得られる場合が多いですが、反応性に問題があるときは0.2～1.0 μMの範囲で最適な濃度をご検討ください。＊2 DNA template の場合は、100 ng以下を用いることを推奨します。cDNA template（RT反応液）の場合は、添加量をPCR反応液容量の10％以下にしてください。＊3 各装置の推奨容量に従って調製ください。 - 反応を開始する。
PCR反応は、下記のシャトルPCR標準プロトコールで行うことをお勧めします。まずはこのプロトコールを試し、必要に応じてPCR条件を至適化してください。
Tm値が低めのプライマーなど、シャトルPCRでの反応が難しい場合には、3ステップPCRを行います。（PCR条件を至適化する場合は、「実験条件の選び方」をご参照ください。）
シャトルPCR標準プロトコール
Reaction Volume：20 μl
Hold（初期変性）*4
95℃、30秒
Cycle：1
2 Step2 Amplification95℃、5秒
60℃、10秒
Cycle：40
Melting95℃、1分
60℃、15秒
98℃、5秒
Cycle：1
Cooling35℃、30秒
Cycle：1＊4 PCR産物（dUTPを含む）によるコンタミネーションが疑われる場合には、初期変性の前に25℃ 2～10分のステップを実施してください。UNGの作用により前回の実験からキャリーオーバーしたPCR産物が分解されます。
※使用上の注意
本製品に使用している変異型Taq HSはポリメラーゼ活性を抑制する抗Taq抗体を利用したホットスタートPCR用酵素です。他社の化学修飾タイプのホットスタートPCR酵素で必要なPCR反応前の95℃（5～）15分の活性化ステップは行わないでください。必要以上の熱処理を加えると酵素活性が低下し、増幅効率、定量精度に影響を及ぼす傾向があります。PCR反応前に鋳型の初期変性を行う場合でも、通常95℃ 30秒で充分です。 - 反応終了後、増幅曲線と融解曲線を確認し、定量を行う場合は検量線を作成する。
解析方法は、各装置の取扱説明書をご参照ください。
