phi29 DNA Polymerase

【目的】
製造におけるIVT鋳型の調製は主に大腸菌による増幅であり、短時間で大量にIVT鋳型を得ることができない。
phi29 DNA Polymeraseを用いることで短時間で大量にIVT鋳型を得ることを目的とした。

【方法】
phi29 DNA Polymeraseを用い、FLuc BspQ I vector（環状）5 ngを鋳型として20 μl反応系にて30℃で16時間増幅反応を行った。プライマーは、random primer（3‘ Phosphorothioate-modified Random Hexamer（製品コード 3807））またはホスホロチオエート修飾により3’末端を保護^＊したspecific primerまたは未修飾specific primerを用った（反応詳細は図1参照）。
反応後のサンプルを精製したのちBspQ I処理し、得たサンプルそれぞれを鋳型としてTakara IVTpro T7 mRNA Synthesis Kit (low dsRNA)（製品コード 6134）またはTakara IVTpro T7 mRNA Synthesis Kit（製品コード 6144）を用いて、IVT反応を行った。同時に、ポジティブコントロールとして、直線化したFLuc BspQ I vectorを鋳型としたIVT反応も行った。
反応後の各サンプルについて、mRNA収量の測定と、アガロースゲル電気泳動を行った。

鋳型	使用したプライマー
IVT鋳型-1	random primer
IVT鋳型-2	ホスホロチオエート修飾により3’末端を保護＊したspecific primer
IVT鋳型-3	未修飾specific primer

＊phi29 DNA Polymeraseのエキソヌクレアーゼ活性による分解を保護する目的

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95℃　5 min、氷冷2 min
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1 μl phi29 DNA Polymerase（10 U/μl）
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30℃　16 h
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精製
図1．phi29 DNA Polymeraseを用いたIVT鋳型作製の手順

【結果】 どのIVT鋳型を用いた場合も、ポジティブコントロールと同等の収量と品質のmRNAが得られることが示された。
ただし、特異的プライマーを使用する場合は、phi29 DNA Polymeraseの3’-5’エキソヌクレアーゼ活性によりプライマーが分解され、IVT鋳型の増幅が妨げられる可能性がある。そのため、3’末端が保護修飾されたプライマーの使用を推奨する。