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(A)2時間の反応後、電気泳動を行い増幅したDNAを確認した。
その結果、phi29 DNA Polymerase(Takara)は、他社の酵素と比べてより少ない鋳型量で高いDNA収量が得られ、反応液に鋳型を含まないNTCの増幅は確認されなかった。一方で、感度の高い他社酵素もあるが、いずれもNTCにおいてDNA増幅が確認された。
(B)0.5 ngのpUC19 DNAを鋳型とした増幅反応2時間後および4時間後に、反応液20 µl当たりのDNA収量を測定した。
その結果、phi29 DNA Polymerase(Takara)は高いDNA収量を得られることを確認した。また、そのDNA収量は他社の変異体酵素にも匹敵するということが示された。
phi29 DNA Polymerase | 250 U |
10× phi29 DNA Polymerase Reaction Buffer | 250 μl |
dNTP Mixture | 100 μl |
50 mM | Tris-HCl (pH7.5 at 25℃) |
10 mM | (NH4)2SO4 |
20 mM | MgCl2 |
4 mM | DTT |
0.1 mg/ml | BSA |
各 200 μM | dATP・dGTP・dCTP |
100 μM | dTTP |
10 μCi | [3H]-dTTP |
0.25 mg/ml | 活性化サケ精子 DNA |
試薬 | 濃度 | 使用量 | 終濃度 |
Nuclease-free water | - | x μl | - |
10×phi29 DNA Polymerase Reaction Buffer | 10× | 2 μl | 1× |
3' PS-modified Random Hexamer*1、2 | 500 μM | 2 μl | 50 μM |
dNTP Mixture | 各10 mM | 4 μl | 各2 mM |
DNA template*3 | - | 0.5 ng | 25 pg/μl |
Total | 19 μl |
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