Alkaline Phosphatase（BAP, CIAP）による脱リン酸化反応
Polynucleotide Kinaseにより核酸の5’末端を32Pで標識する際に、核酸の5’末端のリン酸をAlkaline Phosphataseであらかじめ除去しておくと、高い標識効率が得られる。また、異種DNAのクローニングの際にも、ベクター側の5’末端リン酸をAlkaline Phosphataseで処理しておくと、ベクターだけのセルフライゲーションが防げるため、形質転換細胞のバックグラウンドを下げることができる。
添付Bufferを用いる脱リン酸化反応
マイクロチューブ内で次の反応液を調製し、全量を50 μl にする。
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BAPの場合、37～65℃で30分間インキュベートする。
CIAPの場合は37℃で、30分または50℃で、30分間インキュベートする。または37℃で、15分インキュベートした後、50℃で、15分間インキュベートする。*3
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フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール（25：24：1）で抽出する（2回）。*4
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クロロホルム/イソアミルアルコール（24：1）で抽出する。
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2.5 μlの3 M NaClを加える（終濃度150 mM）。
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エタノール沈殿（2.5倍量の冷エタノールを加え、－20℃で30～60分間保冷後、遠心分離）
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沈殿を200 μlの70％冷エタノールで洗浄後、乾燥
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TE Buffer（20 μl以下）に溶解
| DNA fragments（1～20 pmol) |
| 滅菌精製水 |
| 10× Alkaline Phosphatase Buffer*1 5 μl |
| Bacterial Alkaline Phosphatase（5 U/μl） 1～2 μl*2 または Calf Intestinal Alkaline Phosphatase（30 U/μl） 1～2 μl*2 |
BAPの場合、37～65℃で30分間インキュベートする。
CIAPの場合は37℃で、30分または50℃で、30分間インキュベートする。または37℃で、15分インキュベートした後、50℃で、15分間インキュベートする。*3
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フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール（25：24：1）で抽出する（2回）。*4
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クロロホルム/イソアミルアルコール（24：1）で抽出する。
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2.5 μlの3 M NaClを加える（終濃度150 mM）。
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エタノール沈殿（2.5倍量の冷エタノールを加え、－20℃で30～60分間保冷後、遠心分離）
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沈殿を200 μlの70％冷エタノールで洗浄後、乾燥
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TE Buffer（20 μl以下）に溶解
| *1 | 10× Alkaline Phosphatase Buffer 500 mM Tris-HCl、pH9.0, 10 mM MgCl2 |
| *2 | DNAの5’末端1 pmolあたり、BAP、CIAP共に0.01～0.1 Uは必要である。しかし、DNAが制限酵素で切断後、エタノール沈殿で精製されていないときは、完全分解に必要な酵素量はさらに1～2桁多くなる。 |
| *3 | 一本鎖や5’突出末端の核酸は弱い条件でも充分に脱リン酸化されるが、平滑末端や3’突出末端の場合は高い温度で処理する方がよい。特にBAPによるニック部分の脱リン酸化処理は65℃、30分で行うのが望ましい1)。 |
| *4 | BAPの場合は必ず2回おこなう必要がある。CIAPの場合は1回でもかまわない。 |
