BcaBEST™ RNA PCR Kit Ver. 1.1

Standard Protocol
 (BcaBEST™ RNA PCR Kit Ver.1.1)

■ 操作手順

A.逆転写反応

  1. 下記に示す反応液を調製する。
    試薬使用量最終濃度
    MgSO4(25 mM)2 μl5 mM
    Bca 1st Buffer5 μl
    RNase Free dH2O0.75 μl 
    dNTP Mixture(各10 mM)0.5 μl0.5 mM
    RNase Inhibitor0.25 μl1 U/μl
    BcaBEST polymerase(22 U/μl)0.5 μl1.1 U/μl
    Random 9 mers
        or
    Oligo dT Primer
        or
    特異的下流プライマー
    (R-1 Primer)
    0.5 μl2.5 μM
     or
    0.125 μM
     or
    1 μM
    Positive Control RNA
        or
    Experimental Sample
    0.5 μl[1×105 copies]
     or
    [≦ 500 ng total RNA]
    Total10 μl/sample 
    * Experimental Sampleは発現量の少ないRNAの場合、Volumeを1.25 μlまで持ち込むことが可能。
  2. A. -1の反応液を混合後、ミネラルオイルを重層する。
    (TaKaRa Thermal Cycler Dice、GP、SP、MP、PERSONALの場合不要)
    反応に用いるプライマーは、Random 9 mers、Oligo dT Primer、特異的下流プライマー(Positive Control RNAの場合はControl R-1 Primer)のいずれかを選ぶ。
    調製済みのチューブをサーマルサイクラーにセットし、次のプログラムで反応を行う。
    PCRプログラム

B.PCR反応

  1. 下記に示す反応液を調製する。
    試薬使用量最終濃度
    MgSO4(25 mM)3 μl2.5 mM
    5 × Bca 2nd Buffer8 μl
    Bca-Optimized Taq0.25 μl 2.5 U/50 μl
    上流センスプライマー(20 μM)
    (Control RNAの場合F-1 Primer)
    0.5 μl 0.2 μM
    下流アンチセンスプライマー(20 μM)
    (Control RNAの場合R-1 Primer)
    0.5 μl 0.2 μM
    滅菌精製水27.75 μl 
    Total40 μl/sample 
    1'. 上記反応条件で増幅産物が得られないサンプルの場合(変法)
      以下の反応組成をお試しください。改善される場合があります。
    試薬使用量最終濃度
    MgSO4(25 mM)3 μl2.5 mM
    Bca 1st Buffer20 μl
    Bca-Optimized Taq0.25 μl 2.5 U/50 μl
    上流センスプライマー(20 μM)0.5 μl 0.2 μM
    下流アンチセンスプライマー(20 μM)0.5 μl 0.2 μM
    滅菌精製水15.75 μl 
    Total40 μl/sample 
  2. 1.の反応液 40 μlをA-2. で逆転写反応を終了したチューブに添加する。
  3. マイクロ遠心機で約10秒間、遠心する。
  4. 調製したチューブをサーマルサイクラーにセットし、至適プログラムで増幅させる。
    一般的な反応条件
    94℃30 sec25~30 cycles
    37~65℃30 sec
    72℃1~10 min
    72℃5 min 
    Positive Control RNAの場合
    94℃30 sec28 cycles
    60℃30 sec
    72℃1 min
  5. 反応終了後、反応液の一部(5~10 μl)でアガロースゲル電気泳動を行い、反応産物を確認する。
    PCR増幅産物は解析するまで凍結保存する。

■ Positive Control RNAの増幅サイズ

逆転写反応プライマーPCR Primers増幅断片
Oligo dT Primer Control F-1Primer
     &
Control R-1 Primer
462 bp
Random 9 mers
R-1 Primer

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