TaKaRa RNA LA PCR™ Kit (AMV) Ver.1.1

（1）逆転写反応

1. 下記に示す反応液を調製する。
   

   試薬	使用量	最終濃度
   MgCl2	2 μl	5 mM
   10 × RNA PCR Buffer	1 μl	1 ×
   RNase Free dH2O	4.25 μl
   dNTP Mixture（各10 mM）	1 μl	各1 mM
   RNase Inhibitor	0.25 μl	1 U/μl
   AMV Reverse Transcriptase XL*1	0.5 μl	0.25 U/μl
   Random 9 mers 　　　　or Oligo dT-Adaptor Primer 　　　　or 特異的下流PCRプライマー （R-1 Primer）	0.5 μl	2.5 μM 　or 0.125 μM 　or 1 μM
   Positive Control RNA 　　　　or Experimental Sample	0.5 μl	［1 ×105 copies］ 　or ［≦ 500 ng total RNA］
   Total	10 μl/sample

   *1 AMV Reverse Transcriptase XLはcDNAに結合しているため、そのままPCRを行うと反応を阻害する。（1）-1の反応液の場合、99℃、5分でAMV Reverse Transcriptase XLは失活し、PCRに対する阻害もなくなる。もし、Reverse Transcriptaseの濃度が増えると不活性化が難しくなるので、長鎖のRNAの場合はReverse Transcriptaseの量を増やすよりも、反応時間を長くすることを勧める。
   
2. 反応に用いるプライマーは、Random 9 mers、Oligo dT-Adaptor Primer、特異的下流PCRプライマー（Control RNAの場合はR-1 Primer）のいずれかを選ぶ。
   
   調製済のチューブをサーマルサイクラーにセットし、次のプログラムで反応を行う。
   

   （30℃、10 min）*2	1 cycle
   42～60℃*3、15 min～30 min
   99℃、5 min*4
   5℃、5 min

   *2 プライマーにRandom 9 mersを用いる場合は、Random 9 mersがサンプルRNAと42～60℃で充分アニーリングできるような長さになるまで伸長するように、あらかじめ30℃で10分間逆転写反応を行うこと。
   *3 AMV由来Reverse Transcriptaseは60℃でも逆転写反応を行うことができる。ただし、高温で反応性の悪い場合は42℃付近での反応を勧める。
   *4 長鎖を増幅する場合は、1stストランドcDNAにニックなどのダメージを与えないように70℃、15 minの失活操作を行うこと。
   

（2）PCR反応

1. 下記に示す反応液を調製する。
   

   試薬	使用量	最終濃度
   MgCl2	3 μl	2.5 mM
   10×LA PCR Buffer II（Mg2＋ Free）	4 μl	1×
   滅菌精製水	31.75 μl
   TaKaRa LA Taq	0.25 μl	12.5 U/50 μl
   上流PCRプライマー （Control RNAの場合F-1 Primer）	0.5 μl	0.2 μM
   下流PCRプライマー*5 ［Control RNAの場合R-1 Primer、またはM13 M4 Primer （逆転写の際Oligo dT-Adaptor Primerを用いた場合）］	0.5 μl	0.2 μM
   Total	40 μl/sample

   *5 逆転写反応で下流PCRプライマーを用いた場合は、下流PCRプライマーの代わりに滅菌精製水を0.5 μl加える。
2. 1. の反応液40 μlを（1）-2.で逆転写反応を終了したチューブに添加する。
3. マイクロ遠心機で約10秒間遠心する。
4. 調製したチューブをサーマルサイクラーにセットし、至適プログラムで増幅させる。

   94℃、 2 min	1 cycle
   94℃、 30 sec	25～35 cycles
   55～65℃、 30 sec
   72℃、 X min*6

   *6 約 1 kb/1 minで設定する。
   プライマーのTm値が高い場合には、シャトルPCR (2ステップPCR)も有効である。
   

   94℃、 2 min	1 cycle
   94℃、 30 sec	25～35 cycles
   65～68℃、 X min*6

   *6 68℃の場合、約 1 kb/1 minで設定する。
5. 反応終了後、反応液の一部（5～10 μl）で、アガロースゲル電気泳動を行い、反応産物を確認する。PCR増幅産物は解析するまで凍結保存しておく。
   表1 コントロールRNAを用いた場合の増幅断片（bp）
   

   逆転写反応primer	PCR primers	増幅断片
   Oligo dT-Adaptor Primer	F-1とM13 Primer M4 またはF-1とR-1	約1.2 kb 462 bp
   Random 9 mers	F-1とR-1	462 bp
   Control R-1 Primer	F-1とR-1	462 bp

• アニーリング温度
  Positive Control RNAの場合は60℃で行うが、実際のサンプルの場合は条件が変わる。長鎖の増幅には25 mer程度のプライマーを使用することが多いため、通常、55～65℃の範囲で至適温度を検討する。
• 伸長時間
  伸長時間はターゲットの長さに応じて設定する。通常、68～72℃で約 1 kb/1分を目安とする。
• サイクル数
  cDNA量が少ない場合は、40～50 cycles行う必要がある。