PrimeScript™ II 1st strand cDNA Synthesis Kit
1st-strand cDNA合成反応
PrimeScript™ II 1st strand cDNA Synthesis Kit（製品コード 6210A/B）
[ 標準プロトコール ]
- マイクロチューブ内で以下の液を混合する。
| 試薬 | 使用量 |
|---|
Oligo dT Primer（50 μM）
or Random 6 mers（50 μM） |
1 μl
or 1 μl（0.4～2 μl）*1 |
| dNTP Mixture（10 mM each） | 1 μl |
| 鋳型RNA | total RNA：5 μg以下
polyA＋ RNA：1 μg以下 |
| RNase Free dH2O | up to 10 μl |
- 65℃で5分間保温した後、氷上で急冷する。
＜重要＞この操作により鋳型RNAが変性し、逆転写効率が向上します。
- 以下の反応液を加え、全量を20 μlにする。
| 試薬 | 使用量 |
|---|
| 2. の変性済み混合液 | 10 μl |
| 5×PrimeScript II Buffer | 4 μl |
| RNase Inhibitor（40 U/μl） | 0.5 μl（20 U） |
| PrimeScript II RTase（200 U/μl） | 1 μl（200 U） |
| RNase Free dH2O | up to 20 μl |
- 穏やかに撹拌する。
- 速やかに以下の条件で反応を行う。
| 30℃ | | 10 | min.（Random 6 mers使用時のみ） |
| 42℃（～50℃）*2 | | 30～60 | min. |
- 95℃で 5分間保温*3（酵素失活）した後、氷上で冷却する。
| *1 | ランダムプライマ－で2 kb未満の鎖長のcDNAを合成する場合は1～2 μl、2 kb以上の鎖長のcDNAを合成する場合は0.4～1 μlを使用することをお勧めします。Gene Specific Primerも使用可能です。その場合、最終濃度0.1 μMとなるように反応系に加えてください。 |
| *2 | PrimeScript II RTaseは高次構造にも強い伸長性を示すので、通常の反応は42℃を推奨します。RT-PCRにおいて、PCR下流プライマーを逆転写プライマーとして使用するとミスプライミングによる非特異的な増幅産物が生じる場合がありますが、そのような場合には逆転写反応温度を45～50℃にすることで改善が見られることがあります。 |
| *3 | 長鎖を増幅する場合は、1st strand cDNAにニックなどのダメージを与えないように、70℃、15分の失活操作を行ってください。 |
PrimeScript™ II 1st strand cDNA Synthesis Kit
