T4 DNA Ligaseによるプラスミドベクターへの外来DNAのライゲーション反応例
操作手順
- 以下の反応液を調製する。
10×ligation buffer*1 2 μl ベクターDNA 50 ng インサートDNAフラグメント (ベクターDNAのモル比で約3倍量）*2 T4 DNA Ligase (350 U/μl) 1 μl 滅菌蒸留水 total 20 μl - cohesive末端（粘着末端）の場合、16℃、1～5時間反応する。
blunt末端（平滑末端）の場合、16℃、1～24時間反応 する。*3 - 反応液の一部を形質転換に用いる。*4 反応液を保存する場合は、－20℃で保存する。
| *1 | T4 DNA Ligase（製品コード 2011A/B）に添付 （660 mM Tris-HCl (pH7.6)、66 mM MgCl2、100 mM DTT、1 mM ATP） |
| *2 | DNAのサイズや、ベクターの脱リン酸化の有無、DNA末端の種類によって、最適のベクター：インサート比は変わりますので、ベクター：インサート=1：1から1：10ぐらいまでの間で検討してください。 |
| *3 | ライゲーションされにくい場合は、時間をのばしてください。長時間（16時間以上）反応する場合は、4℃でも反応が行えます。 |
| *4 | エレクトロポレーション等必要がある場合は、反応液をフェノール抽出、エタノール沈殿を行ってから、次の反応に用いてください。 |
