Applied Biosystems 7300/7500 Real-Time PCR SystemおよびStepOnePlus Real-Time PCR Systemを用いる場合の操作方法
One Step TB Green™ PrimeScript™ PLUS RT-PCR Kit (Perfect Real Time) （製品コード RR096A/B）
- 下記に示すPCR反応液を調製する。
＜1反応あたり＞
試薬 使用量 使用量 最終濃度 2×One Step TB Green RT-PCR Buffer 4 10 μl 25 μl 1× TaKaRa Ex Taq HS Mix 1.2 μl 3 μl PrimeScript PLUS RTase Mix 0.4 μl 1 μl PCR Forward Primer（10 μM） 0.8 μl 2 μl 0.4 μM*1 PCR Reverse Primer（10 μM） 0.8 μl 2 μl 0.4 μM*1 ROX Reference Dye or Dye II（50×）*3 0.4 μl 1 μl 1× total RNA 2 μl 4 μl*2 RNase Free dH2O 4.4 μl 12 μl Total 20 μl*4 50 μl*4
*1 最終primer濃度は0.4 μMで良い結果が得られる場合が多いが、反応性に問題があるときは0.1～1.0 μMの範囲で最適な濃度を検討すると良い。
*2 50 μl反応液あたりtotal RNA 20 pg～200 ngをtemplateとして使用することが望ましい。
*3 ROX Reference Dye II（50×）は、ROX Reference Dye（50×）より濃度を低く設定している。Applied Biosystems 7500/7500 Fast Real-Time PCR Systemで解析する場合には、ROX Reference Dye II（50×）を使用する。
StepOnePlus および7300 Real-Time PCR System には、ROX Reference Dye（50×）を使用する。*4 96ウェルプレート、シングルチューブおよび8連チューブでの反応は50 μl反応系で行う。384ウェルプレートおよびFast System用の96ウェルプレート、8連チューブ（0.1 ml）での反応は20 μl反応系で行う。
- 反応を開始する。
PCR反応は、下記のシャトルPCR標準プロトコールで行うことをお勧めします。まずは、このプロトコールを試し、必要に応じてPCR反応条件を至適化してください。Tm値が低めのプライマーなど、シャトルPCRでの反応が難しい場合には、3ステップPCRを行います。
＊StepOnePlusは30秒、7300は31秒、7500は34秒に設定する。
＜Applied Biosystems 7300/7500 Real-Time PCR System、StepOnePlus＞
Stage 1, 2 ：逆転写反応
Reps：1
42℃ 5分
95℃ 10秒
Stage 3：PCR反応
Reps：40
95℃ 5秒
60℃ 30～34秒*
Stage 4：Dissociation Protocol
＜7500 Fast Real-Time PCR System＞
Holding Stage
42℃ 5分
95℃ 10秒
Cycling Stage
Number of Cycles：40
95℃ 3秒
60℃ 30秒
Melt Curve Stage
※使用上の注意
本製品に使用しているTaKaRa Ex Taq HS はポリメラーゼ活性を抑制する抗Taq抗体を利用したホットスタートPCR用酵素です。他社の化学修飾タイプのホットスタートPCR酵素で必要なPCR反応前の95℃、（5～）15分の活性化ステップは行わないでください。必要以上の熱処理を加えると酵素活性が低下し、増幅効率、定量精度に影響を及ぼす傾向があります。PCR反応前に逆転写酵素の熱失活を行なうには、通常95℃10秒で充分です。 - 反応終了後、解析を行う。
反応終了後、増幅曲線と融解曲線を確認し、定量を行う場合は検量線を作成する。*
* 解析方法は、各リアルタイムPCR装置の取扱説明書を参照してください。
One Step TB Green® PrimeScript™ PLUS RT-PCR Kit (Perfect Real Time)
