TB Green^® Premix Ex Taq™ GC (Perfect Real Time)

1. 下記に示すPCR反応液を調製する。
   

   ＜1反応あたり＞

   試薬	使用量	最終濃度
   TB Green Premix Ex Taq GC (2×)	12.5 μl	1×
   PCR Forward Primer (10 μM)	0.5 μl	0.2 μM*1
   PCR Reverse Primer (10 μM)	0.5 μl	0.2 μM*1
   template (＜100 ng)	2 μl	*2
   滅菌精製水	9.5 μl
   Total	25 μl

   *1 最終primer濃度は0.2 μMで良い結果が得られる場合が多いが、反応性に問題がある時は0.1～1.0 μMの範囲で最適な濃度を検討すると良い。

   *2 template溶液中に存在するターゲットのコピー数により異なる。段階希釈して適当な添加量を検討する。DNA template 100 ng以下を用いることが望ましい。また、RT-PCRでcDNA (RT反応液) をtemplateとして添加する場合は、添加量をPCR反応液容量の10％以下とする。




2. PCRチューブをSmart Cycler用遠心機で軽く遠心後、Smart Cyclerにセットし、反応を開始する。
   PCR反応は、下記のシャトルPCR標準プロトコールで行うことをお勧めします。まずはこのプロトコールを試し、必要に応じてPCR反応を至適化してください 。PCR条件を至適化する場合は、下記の「PCR反応条件について」を参照してください。
   
   　シャトルPCR標準プロトコール
   
   　　Stage 1：初期変性
   　　　　Hold：1
   　　　　95℃　30秒
   
   　　Stage 2：PCR反応
   　　　　40サイクル
   　　　　95℃　10秒
   　　　　60℃　30秒
   
   　　Stage 3：Melt Curve
   ※使用上の注意
   本製品に使用しているTaKaRa Ex Taq HSはポリメラーゼ活性を抑制する抗Taq抗体を利用したホットスタートPCR用酵素です。他社の化学修飾タイプのホットスタートPCR酵素で必要なPCR反応前の95℃（5～）15分の活性化ステップは行わないでください。必要以上の熱処理を加えると酵素活性が低下し、増幅効率、定量精度に影響を及ぼす傾向があります。
   PCR前に鋳型の初期変性を行う場合でも、通常95℃30秒で充分です。



3. 反応終了後、増幅曲線と融解曲線を確認し、定量を行う場合は検量線を作成する。
   解析方法は、Smart Cycler Systemの取扱説明書をご参照ください。

PCR条件について