LymphoONE™ T-Cell Expansion Xeno-Free Medium

培養プレートを用いたレトロネクチン共刺激によるTリンパ球(T細胞)拡大培養の方法

【 方法 】

<セットアップ;Day 0>
A) 12 well plateへのAnti-CD3 mAb GMP grade(製品コード T210)RetroNectin(製品コード T100A/B)のコーティング
  1. Anti-CD3 mAb GMP grade(5 μg/ml)とRetroNectin(25 μg/ml)を含む血液保存液(ACD-A)、またはPBS溶液を調製する。12 well plate 1ウェルあたり4.5 ml(1.2 ml/cm2)必要となる。
  2. 調製した溶液を12 well plateに4.5 ml/wellで添加する。
  3. 37℃、5% CO2インキュベーター内で5時間以上保温、または4℃ O/Nでコーティングする。
  4. コート液を全量除去する。
  5. 1 wellあたり5 mlのPBSを用いて3回洗浄する。
    ※最後の洗浄液は、PBMCを播種する直前に除去する。
B) PBMCの播種
  1. 0~1%のヒト血清あるいは血漿を含むLymphoONE T-Cell Expansion Xeno-Free Mediumで1×106 cells/mlのPBMC懸濁液を調製する。
  2. Aでコーティング処理した12 well plateに、PBMC懸濁液を0.5 ml/well添加する。
  3. 0~1%のヒト血清あるいは血漿を含むLymphoONE T-Cell Expansion Xeno-Free Mediumを4.5 ml/well添加し、さらにIL-2を終濃度200 U/ml(~1,000 U/ml)となるように添加する。
  4. 37℃、5% CO2インキュベーター内で培養する。
<Day 4>
C) 継代
  1. 12 well plateの細胞培養液上清を約3 ml回収し、15 ml tubeに移す。
  2. 12 well plateの細胞をピペッティングにより懸濁し、細胞懸濁液の全量を1.の15 ml tubeに加える。細胞が剥がれにくいため、20回以上ピペッティングしてよく懸濁する。
  3. 顕微鏡でプレートに細胞がほとんど残っていないことを確認する。
  4. T25 flaskに0~1%のヒト血清あるいは血漿を含むLymphoONE T-Cell Expansion Xeno-Free Mediumを6.9 ml添加する。
  5. 15 ml tubeに回収した細胞液をよく懸濁し、T25 flaskに0.9 ml添加する。
  6. IL-2を終濃度200 U/ml(~1,000 U/ml)となるように添加する。
  7. 37℃、5% CO2インキュベーター内で、フラスコを立てて培養継続する。
<Day 7>
D) 継代
  1. 新しいT25 flaskにLymphoONE T-Cell Expansion Xeno-Free Mediumを7.8 ml添加する(血清、血漿は添加する必要無し)。
  2. 培養7日目のT25 flaskより細胞液および培地の全量(7.8 ml)を回収し、1.で用意したT25 flaskに添加する。
  3. IL-2を終濃度200 U/ml (~1,000 U/ml)となるように添加する。
  4. 37℃、5% CO2インキュベーター内でフラスコを立てて培養継続する。

表: 培養例
  Day 0
(接着培養)
Day 4
(浮遊培養)
Day 7
(浮遊培養)
Day 10
細胞数 5×105 cells     細胞回収
各種評価、
アッセイへ
細胞液量 0.5 ml 0.9 ml 7.8 ml
培地液量 4.5 ml 6.9 ml 7.8 ml
合計 5.0 ml 7.8 ml 15.6 ml
培養面積 3.8 cm2 10 cm2
12 well plate T25 flask

(ご注意)レトロネクチンを用いたリンパ球拡大培養を研究目的以外で実施する場合は、個別に弊社とのライセンス契約の締結が必要となります。

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