残留不純物試験、純度・同一性試験

遺伝子治療への関心が高まる中、in vivo遺伝子治療においてはアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターは最も期待されているツールであり、すでに臨床にも応用されています。
AAVベクターの力価測定には一般的にqPCR法が用いられていますが、Droplet Digital PCR（ddPCR）法を用いることにより、より高精度の力価測定が可能となります。

・	標準曲線を使用しない		→	精度の高い測定が可能
・	約20,000個に分割された液滴（droplet）で個別にPCR反応が進行するためPCR阻害物質の影響が少ない

qPCRおよびddPCRにおける定量の仕組みとAAVサンプルにおける定量試験結果例

⇒ ddPCR法では、qPCR法と比較して低い変動係数であることが確認されました。

1. ターゲットとする配列の決定およびプライマー・プローブの設計
2. 予備検討：コントロール検体および人工合成プラスミドを用いてプライマー・プローブの反応性を確認いたします。
3. 本試験：ご要望のグレード（簡易試験、信頼性保証、GMP）で実施いたします。GMP試験をご希望の場合は事前のバリデーションが必要となります。

AAVベクターのITRをターゲットとしたプライマーおよびプローブを用いて力価を測定しました。

• 人工合成プラスミドを用いた予備検討
  
  
  

  図1．各Dropletにおける蛍光強度解析結果

  
  

  図2．人工合成プラスミドの実測値と理論値の相関性の確認結果

  段階希釈した人工合成プラスミドを用いて、プライマー・プローブの反応性を確認しました。ダイナミックレンジ内で直線性が担保され、人工合成プラスミドおよびプライマー・プローブの反応性に問題がないことが確認できました。

• AAVベクター（模擬サンプル）を用いた試験
  

  図3．各Dropletにおける蛍光強度解析

  表1．解析結果

  

  希釈倍率	コピー数 （N=3平均）（copies/µl）	タイター （N=3平均）（copies/µl）	Accepted Droplets （N=3平均）（PCR n=3）	Positives per Accepted Droplets	％CV （PCR n=3）
  10	-	-	19,283	0.00	-
  102	-	-	19,485	0.00	-
  103	-	-	19,640	0.00	-
  104	2,783	5.57×109	19,866	0.91	1％
  105	296	5.91×109	21,007	0.22	3％
  106	29.2	5.83×109	21,202	0.02	5％

反応性に問題のないことが確認できたプライマー・プローブおよびAAVベクター（模擬サンプル）を用いて試験を実施したところ、10⁴～10⁶倍希釈においてCV値10％以下でタイターを特定することができました。一方、ダイナミックレンジから大きく外れる希釈倍率ではデータ取得ができない結果となっており、サンプルを最適なコピー数に希釈することが、正しい結果取得に重要です。