アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクター作製

遺伝子治療製品として注目されるアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターに対して、Sequel IIロングリードシーケンサーを用いた解析を行い、ベクターゲノム構造の確認およびベクターゲノム領域内の変異を確認することで、AAVベクターの品質確認におけるNGSロングリード解析の有効性を評価しました。

実験方法：
＜ZsGreen1発現AAVベクターの作製＞
AAVpro Helper Free System（製品コード 6673、6230、6650、6651）、pAAV-ZsGreen1 Vector（製品コード 6231）を用い、AAV1の血清型のCapsidを持つAAV-ZsGreen1ウイルスベクターを作製した。作製したウイルスは、弊社の研究受託の標準手順であるCsCl超遠心法により精製を行い、Amiconにより濃縮した。

＜ウイルスゲノムDNAの抽出とNGS解析＞

1. NucleoSpin Virusを用いて、AAVベクターDNAを抽出精製し、アニーリングにより二本鎖を形成させた。
2. ロングリードライブラリーを構築し、PacBio社のSequel IIロングリードシーケンサーを用いてHiFi Read（CCS：Circular Consensus Sequencing）解析を行った。
3. 得られた全てのリードをベクタープラスミド、AAVベクター産生に用いたヘルパープラスミドおよびホストゲノムの参照配列にマッピングし、マッピングの結果よりAAVベクターのDNA配列確認、およびシーケンスリードの分類によるAAVベクター以外のDNA配列の確認を行った。

結果：
＜AAVベクターの完全長および断片化産物の配列確認＞
NGSの全シーケンスリード配列をpAAV-ZsGreen1ベクタープラスミドにマッピングを実施した結果、シーケンスリード配列の96％以上がITR間のAAVベクター領域にマップされ、88％以上はITRを含む完全長のAAVベクターのゲノム配列を持つことが確認できた。



＜全シーケンスリードの分類結果＞
NGSの全シーケンスリード配列について分類した結果（表1）、AAVベクター由来のリードは全体の96％以上を占め、さらに約2/3は一本鎖DNAゲノム構造をとるsingle-strand AAV（ssAAV）、約1/3はヘアピンDNAゲノム構造をとるself-complementary AAV（scAAV）に分類された。AAVベクター以外のリードは3％以下であり、ヒトゲノム、pRC、pHelperプラスミド由来のシーケンスリード配列やその複合産物等に分類された。またAAVベクター由来のリードのうち88％以上は完全長を含んでおり、一部欠損のあるリードは12％以下であった（表2）。これらの結果より、弊社のCsCl超遠心法で精製されたAAVの純度は、非常に高いことが示された。

表1. AAVベクターシーケンスリード配列の分類結果1

Assign Type	Count	Frequency (％)	Assign Subtype	Frequency (％)
AAV	16,478	97.91	ssAAV（一本鎖AAV）	61.5
			scAAV（自己相補的AAV）	36.41
Other（その他）	352	2.09	other（未分類）	1.6
			repcap（pRCプラスミド）	0.26
			chimeric（複合）	0.17
			host（ヒトゲノム）	0.05
			helper（pHelperプラスミド）	0.02
Total	16,830	100	Total	100

表2. AAVベクターシーケンスリード配列の分類結果2

Assign Type	Count	Frequency (％)
full（完全長）	14,519	88.11
partial（一部欠損）	1,959	11.89
	16,478	100