BcaBEST^® Isothermal FluorDetect Kit (DNA/RNA)

LAMP法の概要

LAMP（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法では、4～6種類のプライマーと鎖置換活性を持つDNAポリメラーゼ（BcaBEST DNA Polymerase ver.2.0（製品コード RR380A/B））を用いて、一定温度（60～65℃）でターゲット領域を増幅します。

ダンベル型DNAの生成ステップ

FIP（Forward internal primer）が結合し、鎖置換活性を持つDNAポリメラーゼが二本鎖DNAを解離させながら5’→3’方向にDNA鎖を伸長します。

F3プライマーが結合、5’→3’方向にDNA鎖が伸長し、FIPから新しく合成されたDNA鎖が解離します。

FIPから新しく合成されたDNA鎖に対して、BIP（Backward internal primer）が結合、5’→3’方向にDNA鎖が伸長します。

B3プライマーが結合、5’→3’方向にDNA鎖が伸長し、BIPから新しく合成されたDNA鎖が解離します。

BIPから新しく合成されたDNA鎖は自己相補的な配列によって、両端にループ構造をもつダンベル型DNAとなります。

ダンベル型DNAと増幅起点

このように生成されたダンベル型DNAから、裏返し構造のダンベル型DNAが生成され、これら2つが次の指数関数的増幅ステップでの鋳型となります。ダンベル型DNAのループ部分に結合したFIPおよびBIPの3’末端と、自己と相補的なF1およびB1領域の3’末端が増幅の起点となります。
また、5’末端側のループ構造に結合する2種類のプライマー（Loop Primer FおよびLoop Primer B）も併用することで、増幅効率が向上します。

指数関数的増幅ステップ

ループ部分に結合したプライマーと自己と相補的な配列を起点としたDNA合成が繰り返され、さまざまなサイズの増幅産物が生成します。
増幅産物はインターカレーター（TB Green Solution（製品コード 9300A））による蛍光検出が可能です。