In-Fusion^® HD EcoDry™ Cloning Kit

Clontech社のIn-Fusionクローニングシステムは、それぞれのDNA断片の末端15塩基が相同であれば、短時間に効率よく、In-Fusion酵素がそれらのDNA断片を融合することができる。制限酵素切断や平滑末端化処理、リガーゼ反応などを行うことなく、1ステップの反応でPCR断片を任意のベクターにクローニングできる。 In-Fusion HD EcoDry Cloning Kitは、室温で保存できる便利な凍結乾燥タイプの試薬で、8連チューブと96ウェルプレートの2種類のタイプが用意されている。各ウェルにはプレミックスのIn-Fusion試薬が含まれているため、線状化ベクターとインサート、滅菌水を加えるだけで反応を開始することができ、作業効率の向上とコンタミネーションリスクの低減を図ることができる。
効率のよいIn-Fusionクローニングなら、最小限のスクリーニングで適切なクローンが得られる。また、2つのDNA断片の結合のみならず、1度の反応で4つのDNA断片を適切に連結することも可能である（1）。In-Fusionクローニング法はハイスループット（HTP）の系にも有用であり、ハーバード大学医学部（2）やスタンフォード大学医学部（3）、オックスフォード大学（4）などのHTPプロジェクトでも活躍している。

1. 利用するベクターの末端配列に相同な15塩基を、目的遺伝子増幅用プライマーの5'末端に付加し、目的遺伝子をPCR増幅する。
2. 非特異的な増幅産物が検出される場合は、ゲルからの切出し精製を行う。シングルバンドが得られた場合はNucleoSpin^*1などにより精製を行う。
3. In-Fusion反応液で形質転換を行い、目的クローンをスクリーニングする。
   ※ 線状化ベクターは、制限酵素処理や全長のPCR増幅により調製してください。

In-Fusionクローニングなら、どんなベクターのどんな制限酵素サイトにでもクローニング可能であり、サブクローニングを行う必要がない。インサートDNAが意図した方向に挿入されたクローンが確実に得られ、余分な塩基の付加も一切ない。
また、ベクターの全長をPCR増幅してIn-Fusion反応を行うことで、制限酵素サイトが存在しない部位へのクローニングも可能である。

本法ではA突出末端が要求されないので、PCR断片の作製にあらゆる耐熱性ポリメラーゼを使用することができる。正確性の高いPCR酵素を用いることで、さらに精度の高いクローニングが可能になる。特に、発現ベクターへのクローニングなどには、PrimeSTAR Max DNA PolymeraseなどPrimeSTAR シリーズ（製品コード R045、R050、R010ほか）などHigh Fidelity PCR酵素の使用を推奨する。
　　　 PrimeSTARシリーズパンフレット

In-Fusion HD EcoDry Cloning Kit （8連チューブ又は96ウェルプレート）

In-Fusionクローニング用プライマーの設計および目的DNA断片の増幅は、基本的に通常のPCRプライマーの設計、PCR増幅と同じである。唯一の違いは、利用するベクターの末端配列に相同な15塩基を、配列特異的プライマーの5’末端に付加することである（下図参照）。

お手持ちのベクターに対するIn-Fusion用プライマーの設計には、便利なオンラインツール「In-Fusion クローニング用プライマー設計サイト（In-Fusion Cloning Primer Design Tool）」をご利用ください。

※ リンク先はTB USA社サイトです。デザインツールが更新され、より使いやすくなりました。


※ これまでお使いいただいていた「In-Fusionクローニング用プライマー設計サイト（Primer Design tool for In-Fusion）」はこちらから

 

In-Fusion HD EcoDry Cloning Kit
（製品コード 639690、639691）
・In-Fusion HD EcoDry Mix
・pUC19 Control Vector, linearized
・2 kb Control Insert

In-Fusion HD EcoDry Mix：デシケーター内で室温保存
コンピテントセル：－80℃
Control Vector、Control Insert：－20℃
NucleoSpin 96 PCR Clean-up：室温

下記よりPDFでご覧いただけます。

印刷物はこちらからご請求ください。

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クローニング操作の基本フロー