- Tet-On AdvancedによるmiRNA誘導システム
- miRNAの発現を蛍光タンパク質でモニタリング
- 高い誘導発現量と低い基底発現レベル
Mir-X Inducible miRNA System（GreenまたはRed）は、目的のmiRNA配列と蛍光タンパク質レポーター（mCherryまたはZsGreen1）を同時に1本のmRNAとして発現する。また、調節性に優れたTet-On Advanced Expression Systemを採用することで、厳密な転写調節を行える。
原理
目的のmiRNA配列は、miRNA Inducibleベクター（pmRi-mCherry VectorまたはpmRi-ZsGreen1 Vector）上にコードされた蛍光タンパク質遺伝子の下流の3’UTR領域にクローニングされる。Tet-On Advanced調節因子を発現する細胞に、miRNA Inducibleベクターをトランスフェクションすると、培地中に添加したDox（ドキシサイクリン；図1、2）の濃度に応じて目的のmiRNAと蛍光タンパク質が発現する。Doxの培地への添加による転写の誘導は素早く、濃度依存的に調節が行える。
miR-1とmiR-9のターゲット配列を分泌性のルシフェラーゼ遺伝子に融合し（RNAi Monitor）、MCF7 Tet-On Advanced Cell中で構成的に発現させ、miRNAの発現誘導をモニターした（図3）。DoxによるmiR-1またはmiR-9の誘導で、ルシフェラーゼ活性（補正後）が、コントロール細胞に比較して90%以上抑制されていた。
赤色または緑色蛍光による検出
Mir-X Inducible miRNAシステムは、DoxによるmiRNA発現調節ベクターのほか、薬剤選択マーカーDNA、専用の血清（FBS）、コントロールベクターと必要になるすべてを含んでいる。また、システムを構成する誘導性のベクターpmRi-mCherry vectorまたはpmRi-ZsGreen1 vectorは単品でも販売しており、クロンテックのTet-On/Off発現調節システムと併せて使用できる。
原理
目的のmiRNA配列は、miRNA Inducibleベクター（pmRi-mCherry VectorまたはpmRi-ZsGreen1 Vector）上にコードされた蛍光タンパク質遺伝子の下流の3’UTR領域にクローニングされる。Tet-On Advanced調節因子を発現する細胞に、miRNA Inducibleベクターをトランスフェクションすると、培地中に添加したDox（ドキシサイクリン；図1、2）の濃度に応じて目的のmiRNAと蛍光タンパク質が発現する。Doxの培地への添加による転写の誘導は素早く、濃度依存的に調節が行える。
miR-1とmiR-9のターゲット配列を分泌性のルシフェラーゼ遺伝子に融合し（RNAi Monitor）、MCF7 Tet-On Advanced Cell中で構成的に発現させ、miRNAの発現誘導をモニターした（図3）。DoxによるmiR-1またはmiR-9の誘導で、ルシフェラーゼ活性（補正後）が、コントロール細胞に比較して90%以上抑制されていた。
赤色または緑色蛍光による検出
Mir-X Inducible miRNAシステムは、DoxによるmiRNA発現調節ベクターのほか、薬剤選択マーカーDNA、専用の血清（FBS）、コントロールベクターと必要になるすべてを含んでいる。また、システムを構成する誘導性のベクターpmRi-mCherry vectorまたはpmRi-ZsGreen1 vectorは単品でも販売しており、クロンテックのTet-On/Off発現調節システムと併せて使用できる。
Tet調節性トランスアクチベーター（Tet-On Advancedタンパク質）は、改変型の大腸菌TetリプレッサーrTetRとHSV-VP16（転写活性化因子）の最小領域を3回反復させて融合している。Doxの存在下でTet-On Advancedタンパク質は誘導性のPTightプロモーターに結合し、蛍光タンパク質遺伝子（mCherryまたはZsGreen1）と、その3’UTRに目的のmiRNA配列をコードする1本のmRNAの転写を活性化する。
pmRi-mCherry VectorまたはpmRi-ZsGreen1 VectorからmiR-1を発現するMCF-7 Tet-On Advanced細胞はDox存在下で強い蛍光を示した。
RNAi Monitorシステムを用いて、miR-1とmiR-9のターゲット配列を分泌性のルシフェラーゼ遺伝子の3’UTRに融合し構成的に発現するベクターを構築した。これらのベクターを、miR-1またはmiR-9 miRNA配列を持つpmRi-ZsGreen1 vectorと共にMCF7 Tet-On Advanced Cellにコトランスフェクションした。pmRi-ZsGreen1 vector（miRNAインサートなし）を陰性コントロールに使用した。DoxによるmiR-1またはmiR-9 miRNAの誘導でルシフェラーゼ活性（補正後）が90%以上の割合で抑制された。
アプリケーション
ドキシサイクリンによるmiRNAの発現調節システム
内容
Mir-X Inducible miRNA System（Red）、または（Green）
（製品コード 631118、または631120）
・pTet-On Advanced Vector
・Tet System Approved FBS, US-Sourced
・pmRi-mCherry Vector（製品コード 631119）（Red systemのみ）、またはpmRi-ZsGreen1 Vector（製品コード 631121）（Green systemのみ）
pmRi-mCherry Vector、またはpmRi-ZsGreen1 Vector
（製品コード 631119、または631121）
・pmRi-mCherry Vector、またはpmRi-ZsGreen1 Vector
・pTRE-Tight-Luc Vector
・Linear Hygromycin Marker
・Linear Puromycin Marker
（製品コード 631118、または631120）
・pTet-On Advanced Vector
・Tet System Approved FBS, US-Sourced
・pmRi-mCherry Vector（製品コード 631119）（Red systemのみ）、またはpmRi-ZsGreen1 Vector（製品コード 631121）（Green systemのみ）
pmRi-mCherry Vector、またはpmRi-ZsGreen1 Vector
（製品コード 631119、または631121）
・pmRi-mCherry Vector、またはpmRi-ZsGreen1 Vector
・pTRE-Tight-Luc Vector
・Linear Hygromycin Marker
・Linear Puromycin Marker
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